(英文)
Methods
Animal studies
Research involving animals complied with protocols approved by the Harvard Medical School/Brigham and Women’s Hospital Committee on Animal Care, and the Institutional Committee of Laboratory Animal Experimentation of the RIKEN Center for Developmental Biology.
方法
動物研究
動物を対象とした研究は、ハーバード大学医学部/ブリガム・ウィミンズ病院の動物実験委員会、理化学研究所発生生物学センターの研究所実験動物組織委員会の承認を受けた。
(英文)
Cell culture
STAP cells were generated from low-pH-treated CD45+ cells, followed by culture in B27 + LIF medium for 7 days, as described1. For Fgf4-induced stem-cell line establishment, STAP cell clusters were transferred to Fgf4-containing trophoblast stem-cell medium9 on MEF feeder cells in 96-well plates. In most cases (40 out of 50 experiments), colonies grew in 10–50% of wells in 96-well plates. In minor cases (10 out of 50 experiments), no colony growth was observed and/or only fibroblast-like cells appeared. The cells were subjected to the first passage during days 7–10 using a conventional trypsin method. Subsequent passages were performed at a split ratio of 1:4 every third day before they reached subconfluency.
STAP stem-cell lines were established as described1. STAP spheres were transferred to ACTH-containing medium1 on MEF feeder cells (several spheres, up to a dozen spheres, per well of 96-well plates). Four to seven days later, the cells were subjected to the first passage using a conventional trypsin method, and suspended cells were plated in ES maintain medium containing 20% FBS. Subsequent passaging was performed at a split ratio of 1:10 every second day before they reached subconfluency.
細胞培養
STAP細胞は、低pH処理CD45 陽性細胞から生成され、続いて既述の通り[1]、B27 + LIF培地中で7日間培養された。 Fgf4誘導幹細胞株樹立ために、STAP細胞クラスターを、96ウェルプレート中のMEFフィーダー細胞上のFgf4含有栄養膜幹細胞培地[9]に移した。 ほとんどの場合（50回の実験のうち40回）、96ウェルプレートの10～50％のウェルでコロニーが増殖した。 稀に（50回の実験のうち10回）、コロニーの成長は観察されないか、または、線維芽細胞様細胞のみが出現した。 細胞は、従来のトリプシン法を用いて7～10日目の間に第1継代に供された。 その後の継代は、サブコンフルに達する前に、3日ごとに1：4の分裂比で実行された。
STAP幹細胞株は既述の通りに[1]樹立された。 STAPスフィアを、MEFフィーダー細胞上のACTH含有培地[1]に移した（96ウェルプレートのウェル当たり、数スフィア、最大12スフィア）。 4～7日後、通常のトリプシン法を用いて細胞を第1継代に供し、懸濁した細胞を20％FBSを含むES維持培地に播種した。 その後の継代は、サブコンフルに達する前に2日ごとに1：10の分割比で行われた。
(英文)
Chimaera mouse generation and analyses
For production of diploid and tetraploid chimaeras with STAP cells, STAP stem cells and Fgf4-induced stem cells, diploid embryos were obtained from ICR strain females. Tetraploid embryos were produced by electrofusion of 2-cell embryos. Because trypsin treatment of donor samples turned out to cause low chimaerism, STAP spherical colonies were cut into small pieces using a microknife under microscopy, and small clusters of STAP cells were then injected into day-4.5 blastocysts by a large pipette. Next day, the chimaeric blastocysts were transferred into day-2.5 pseudopregnant females.
キメラマウスの作成と分析
STAP細胞、STAP幹細胞およびFgf4誘導幹細胞からの、二倍体および四倍体キメラの作成のために、二倍体胚をICR系統の雌から得た。 四倍体胚は2細胞胚の電気融合によって作成された。 ドナー試料のトリプシン処理は低キメニズムを引き起こすことが判明したので、顕微鏡下でマイクロナイフを用いてSTAP球状コロニーを小片に切断し、STAP細胞の小さなクラスターを大型ピペットで4.5日の胚盤胞に注入した。 翌日、キメラ胚盤胞を2.5日の偽妊娠雌に移した。
(英文)
In vivo differentiation assay
1 × 10(to the power of 5) cells of Fgf4-induced stem-cell-derived ES-like cells were injected subcutaneously into the dorsal flanks of 4-week-old NOD/SCID mice. Six weeks later, the implants were collected and histologically analysed. The implants were fixed with 10% formaldehyde, embedded in paraffin, and routinely processed into 4-μm-thick sections. Sections were stained with haematoxylin and eosin. So far, we have not investigated whether Fgf4-induced stem cells form tumours such as teratomas and yolk sac tumours in vivo.
体内分化実験
Fgf4誘導幹細胞由来ES様細胞の1×10の５乗個の細胞を4週齢NOD / SCIDマウスの背側腹部に皮下注射した。 6週間後インプラントを収集し、組織学的に分析した。 インプラントを10％ホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋し、普通のやり方で4μmの厚さに加工した。 切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。 これまでのところ、Fgf4誘導幹細胞が体内で奇形腫や卵黄嚢腫瘍などの腫瘍を形成するかどうかについては検討していない。
(英文)
Immunostaining
Cells were fixed with 4% PFA for 15 min and, after permeabilization, with 0.5% Triton X-100 and then incubated with primary antibodies: anti-H3K27me3 (Millipore; 1:300), anti-Oct3/4 (Santa Cruz Biotechnology; 1:300), anti-Nanog (eBioscience; 1:300), anti-KLF4 (R&D System; 1:300), anti-Esrrβ (R&D System; 1:300) and integrin α7 antibody (R&D system; 1:200). After overnight incubation, bound antibodies were visualized with a secondary antibody conjugated to Alexa546 (Molecular Probes). Nuclei were stained with DAPI (Molecular Probes).
免疫染色
細胞を4％PFAで15分間固定し、0.5％Triton X-100で透過処理後、以下の一時抗体で保温維持した:抗H3K27me3（Millipore; 1：300）、抗Oct3 / 4（Santa Cruz Biotechnology;1：300)、抗Nanog（eBioscience; 1：300）、抗KLF4（R＆D System; 1：300）、抗Esrrβ（R＆D System; 1：300）およびインテグリンα7抗体（R&D system; 1:200 ）。 一晩保温維持した後、結合した抗体をAlexa546（Molecular Probes）を配合した二次抗体で視覚化した。 核をDAPI（Molecular Probes）で染色した。
(英文)
RNA preparation and RT–PCR analysis
RNA was isolated with the RNeasy Mini kit (Qiagen). Reverse transcription was performed with the SuperScript III First Strand Synthesis kit (Invitrogen). Power SYBR Green Mix (Roche Diagnostics) was used for PCR amplification, and samples were run on a Lightcycler-II Instrument (Roche Diagnostics). The primer sets for each gene are listed in Supplementary Table 1.
RNA調製およびRT-PCR分析
RNeasy Miniキット（Qiagen）を用いてRNAを単離した。 逆転写は、SuperScript IIIファーストストランド合成キット（Invitrogen）を用いて行った。 Power SYBR Green Mix（Roche Diagnostics）をPCR増幅に使用し、サンプルをLightcycler-II Instrument（Roche Diagnostics）で実行した。 各遺伝子のプライマーセットを補遺表1に示す。
(英文)
Inhibitor assay
For JAK inhibitor assay, Fgf4-induced stem cells were cultured without feeders for 48 h in trophoblast stem-cell culture medium supplemented with 0.6 μM JAK inhibitor (CalBiochem, 420097). As a control, ES cells were also cultured for 48 h in ES medium supplemented with 0.6 μM JAK inhibitor. After the JAK inhibitor treatment, cells were collected and their gene expression was analysed by RT–PCR. For MEK inhibitor assay, dissociated Fgf4-induced stem cells were plated in either LIF containing ES medium supplemented with 1 μM MEK inhibitor (PD025901) or FGF4 containing trophoblast stem cell medium supplemented with 1 μM MEK inhibitor for 48 h. As controls, dissociated Fgf4-induced stem cells were co-plated with 5% or 50% of ES cells into the same culture conditions. After the MEK inhibitor treatment, colonies that formed in each culture condition were counted.
阻害剤実験
JAK阻害剤実験のために、0.6μMのJAK阻害剤（CalBiochem、420097）を補充した栄養膜幹細胞培養培地中でFgf4誘導幹細胞をフィーダーなしで48時間培養した。 コントロールとして、ES細胞を0.6μMのJAK阻害剤を補充したES培地で48時間培養した。 JAK阻害剤処理の後、細胞を収集し、それらの遺伝子発現をRT-PCRによって分析した。 MEK阻害剤アッセイのために、解離したFgf4誘発幹細胞を1μMのMEK阻害剤（PD025901）を補充したLIF含有ES培地、または1μMのMEK阻害剤を補充した栄養膜幹細胞培地を含むFGF4培地に48時間播種した。コントロールとして、解離したFgf4誘導性幹細胞を、5％または50％のES細胞と共培養した。 MEK阻害剤処理後、各培養条件で形成されたコロニーを数えた。
(英文)
FACS sorting
Fgf4-induced stem cells were dissociated into single cells and were suspended in 0.5% BSA PBS. Suspended cells were Fc-blocked by treatment with 1 μg of mouse IgG per 10(to yhe power of 5) cells for 15 min at room temperature. PE-conjugated integrin α7 antibody (R&D system, FAB3518P, dilution at 1:10) was added into cell suspension, and cells were incubated for 30 min on ice. Finally, cells were rinsed with PBS three times and propidium iodide was added for dead cell elimination. As a control, Fgf4-induced stem cells in a separate tube were treated with PE-labelled rat IgG2B antibody. Integrin α7-positive and -dim cells were sorted by FACS aria II (BD).
FACSソーティング
Fgf4誘導幹細胞を単細胞に解離させ、0.5％BSA PBSに懸濁させた。 懸濁した細胞を、室温で15分間、10の5乗細胞あたり1μgのマウスIgGで処理することによってFc-遮断した。PE結合インテグリンα7抗体（R＆Dシステム、FAB3518P、1:10希釈）を細胞懸濁液に加え、細胞を氷上で30分間インキュベートした。 最後に、細胞をPBSで3回すすぎ、死細胞除去のためにヨウ化プロピジウムを添加した。 コントロールとして、別のチューブ中のFgf4誘導幹細胞をPE標識ラットIgG2B抗体で処理した。 インテグリンα7陽性および 弱発現細胞をFACS aria II（BD）で選別した。
(英文)
RNA sequencing and ChIP sequencing analyses
RNA-sequencing of cell lines was performed with biological duplicate samples. Total RNA was extracted from T cells by the RNasy mini kit (Qiagen). RNA-seq libraries were prepared from 1 μg total RNAs following the protocol of the TruSeq RNA Sample Prep kit (Illumina) and subjected to the deep sequencing analysis with Illumina Hi-Seq1000. A cluster tree diagram of various cell types was obtained from hierarchical clustering of global expression profiles (log2 FPKM of all transcripts; FPKM, fragments per kilobase of transcript per million mapped reads). Complete linkage method applied to 1 － r (r = Pearson’s correlation between profiles) was used for generating the tree and 1,000 cycles of bootstrap resampling were carried out to obtain statistical confidence score in % units (also called AU P values). For the analysis that included morula and blastocyst embryos (only small amounts of RNA can be obtained from them), we used pre-amplification with the SMARTer Ultra Low RNA kit for Illumina Sequencing (Clontech Laboratories). Differentially expressed genes were identified by the DESeq package23.
RNAシークエンシングおよびChIPシークエンシング解析
生物学的二重試料を用いて細胞系のRNA配列決定を行った。全RNAをRNasyミニキット（Qiagen）によりT細胞から抽出した。 RNA-seqライブラリーは、TruSeq RNA Sample Prepキット（イルミナ）のプロトコールに従って1μgの全RNAから調製し、Illumina Hi-Seq1000で深い配列決定分析を行った。全発現プロファイルの（全転写物のlog2 FPKM; FPKMは、マップされた百万リードに対して、転写物のキロベースあたりの断片数を意味する）階層的クラスタリングから、様々な細胞型のクラスターツリー図を得た。ツリーを作成するために、1-r（r=プロファイル間のピアソン相関係数）に適用された完全リンケージ法を使用し、％単位（AU P値とも呼ばれる）で統計的信頼スコアを得るために1,000サイクルのブートストラップ再サンプリングを実施した。桑実胚および胚盤胞胚を含む分析（少量のRNAしか得られない）に関しては、Illumina Sequencing（Clontech Laboratories）用のSMARTer Ultra Low RNAキットで事前増幅を行った。異様発現遺伝子は、DESeqパッケージ23によって同定された。
(英文)
ChIP-seq libraries were prepared from 20 ng input DNAs, 1 ng H3K4me3 ChIP DNAs, or 5 ng H3K27me3 ChIP DNAs using the KAPA Library Preparation kit (KAPA Biosystems). TruSeq adaptors were prepared in-house by annealing a TruSeq universal oligonucleotide and each of index oligonucleotides (5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3′, and 5′-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACXXXXXXATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3′; where X represents index sequences).
Chromatin immunoprecipitation was performed as follows. Cells were fixed in PBS(-) containing 1% formaldehyde for 10 min at room temperature. Glycine was added to a final concentration of 0.25 M to stop the fixation. After washing the cells twice in ice-cold PBS(-), cells were further washed in LB1 (50 mM HEPES-KOH pH 7.5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glycerol, 0.5% NP-40, 0.25% Triton X-100) and LB2 (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5 mM EGTA). Cells were then re-suspended in lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM EDTA, 1% SDS). Lysates were prepared by sonication using COVARIS S220 in a mini tube at duty cycle = 5%, PIP = 70, cycles per burst = 200, and the treatment time of 20 min. Lysates from 2 × 106 cells were diluted in ChIP dilution buffer (16.7 mM Tris-HCl pH 8.0, 167 mM NaCl, 1.2 mM EDTA, 1.1% Triton X-100, 0.01% SDS). ChIP was performed using sheep anti-mouse IgG beads (Invitrogen) or protein A beads (Invitrogen) coupled with anti-histone H3K4me3 antibody (Wako, catalogue no. 307-34813) or anti-histone H3K27me3 antibody (CST, catalogue no. 9733), respectively.
ChIP-seqライブラリーを、20ngの入力DNA、1ngのH3K4me3 ChIP DNA、または5ngのH3K27me3 ChIP DNAから、KAPAライブラリー調製キット（KAPA Biosystems）を用いて調製した。 TruSeqアダプターは、TruSeqユニバーサルオリゴヌクレオチドおよび各インデックスオリゴヌクレオチド（5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGCGCTCTTCCGATCT-3 'および5'-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACXXXXXXATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3';ここで、Xはインデックス配列を表す）のアニーリングによって社内で調製した。
クロマチン免疫沈降は以下のように行った。細胞を1％ホルムアルデヒドを含むPBS（ - ）中で室温で10分間固定した。グリシンを最終濃度0.25Mになるように加えて固定を停止させた。氷冷PBS（ - ）で細胞を2回洗浄した後、LB1（50mM HEPES-KOH pH7.5,140mM NaCl、1mM EDTA、10％グリセロール、0.5％NP-40,0.25％Triton X-100）およびLB2（10mMトリス-HCl pH8.0,200mM NaCl、1mM EDTA、0.5mM EGTA）で洗浄した。次いで、細胞を溶解緩衝液（50mMトリス-HCl pH8.0,10mM EDTA、1％SDS）に再懸濁した。溶解物は、デューティーサイクル= 5％、PIP = 70、バースト当たりのサイクル= 200、および20分の処理時間でミニチューブ中でCOVARIS S220を使用する超音波処理によって調製した。 2×10 の6乗細胞からの溶解物をChIP希釈緩衝液（16.7mMトリス-HCl pH8.0,167mM NaCl、1.2mM EDTA、1.1％Triton X-100,0.01％SDS）で希釈した。 ChIPは、抗ヒストンH3K4me3抗体（Wako、カタログ番号307-34813）または抗ヒストンH3K27me3抗体（CST、カタログ番号9733）と結合したヒツジ抗マウスIgGビーズ（Invitrogen）またはプロテインAビーズ（Invitrogen） ）を使って実施された。
(英文)
After 4–6 h of incubation in a rotator at 4 °C, beads were washed five times in low-salt wash buffer (20 mM Tris HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0.1% SDS), and three times in high-salt wash buffer (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0.1% SDS). Target chromatin was eluted off the beads in elution buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% SDS) at room temperature for 20 min. Crosslink was reversed at 65 °C, and then samples were treated with RNaseA and proteinase K. The prepared DNA samples were purified by phenol-chloroform extraction followed by ethanol precipitation and dissolved in TE buffer.
4℃で回転子中で4～6時間保温した後、ビーズを低塩洗浄緩衝液（20mM Tris HCl pH8.0,150mM NaCl、2mM EDTA、1％Triton X-100,0.1 ％SDS)で5度洗浄し、高塩洗浄緩衝液（20mM Tris-HCl pH8.0,500mM NaCl、2mM EDTA、1％Triton X-100,0.1％SDS）中で3度洗浄した。 溶出緩衝液（10mMトリス-HCl pH8.0,300mM NaCl、5mM EDTA、1％SDS）中、室温で20分間、標的クロマチンをビーズから溶出させた。 65℃で架橋を逆転させた後、サンプルをRNaseAおよびプロテイナーゼKで処理した。調製したDNAサンプルをフェノール - クロロホルム抽出および続いてエタノール沈殿により精製し、TE緩衝液に溶解した。
- 2019/05/14(火) 09:13:57|
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