一言居士の独言

(英文)
Extended Data Figures

1. Extended Data Figure 1: Placental contribution of STAP cells. (295 KB)
a, Chimaeric mouse with STAP cells derived from CD45+ cells of B6GFP × 129/Sv mice (B6GFP, C57BL/6 line with cag-gfp transgene). Arrows indicate a placenta and a yolk sac. b, Cross-sections of yolk sac (top) and placenta (bottom). GFP-positive cells (arrows) were seen only in yolk sac and placenta of the STAP cell chimaera. Scale bars, 50 μm. c, Co-immunostaining showed that these GFP-positive cells (right) were found in the extra-embryonic endoderm-derived epithelial cells (pan-cytokeratin+ and overlying laminin+ basement membrane; left) of the yolk sac. Scale bar, 10 μm.


拡張データ図

1.拡張データ図1：STAP細胞の胎盤寄与。 （295 KB）
a、B6GFP×129 / Svマウス（B6GFP、cag-gfp導入遺伝子を有するC57BL / 6系統）のCD45 陽性細胞に由来するSTAP細胞のキメラマウス。 矢印は、胎盤および卵黄嚢を示す。　　 b、卵黄嚢（上）および胎盤（下）の断面。 GFP陽性細胞（矢印）は、STAP細胞キメラの卵黄嚢および胎盤においてのみ見られた。 スケールバー、50μm。　　 c、共染色結果は、これらのGFP陽性細胞（右）が卵黄嚢の胚外内胚葉由来上皮細胞（汎サイトケラチン陽性かつ重層ラミニン陽性の基底膜;左側）に見出されたことを示した。 スケールバー、10μm。

(英文)
2. Extended Data Figure 2: Trophoblast differentiation potential of Fgf4-induced stem cells. (749 KB)
a, b, Immunostaining (cross-section) of placentae obtained in the blastocyst injection assay with GFP (constitutive)-labelled ES cells (upper) or Fgf4-induced stem cells (bottom). Brown shows pan-cytokeratin and red shows GFP (ES cell or Fgf4-induced stem cell contribution). Regions indicated in a are shown in b. Fgf4-induced stem cells contributed to all layers of placentae, whereas no contribution was observed with ES cells. a, Scale bars, 5 mm. b, Scale bars, 50 μm. c, Pluripotent marker expression of Fgf4-induced stem cells. Scale bars, 50 μm.
d, e, Effects of Fgf4 withdrawal from Fgf4-induced stem cell culture. Unlike trophoblast stem cells (d, left), which generated multi-nucleated large cells (arrow) in the absence of Fgf4, Fgf4-induced stem cells (d, right) simply stopped proliferation and gradually died on Fgf4 withdrawal. Scale bars, 50 μm. This finding suggests that placental differentiation of Fgf4-induced stem cells in vivo may involve more than just Fgf4 signal suppression. e, The number of 4N and 8N cells increased within 6 days of Fgf4 withdrawal in trophoblast stem cells but not in Fgf4-induced stem cells.



2.拡張データ図2：Fgf4誘導幹細胞の栄養膜分化能。 （749 KB）
a,b,GFP（恒常性）標識ES細胞（上）またはFgf4誘導幹細胞（下）を用いた胚盤胞注入実験で得られた胎盤の免疫染色（断面）。 ブラウンは汎サイトケラチンを示し、赤はGFP（ES細胞またはFGF4誘導性幹細胞寄与）を示す。 aに示される領域は、bに示されている。 Fgf4誘導性幹細胞は胎盤のすべての層に寄与したが、ES細胞は寄与しなかった。 a、スケールバー、5mm。 b、スケールバー、50μm。 　　　c,Fgf4誘導幹細胞の多能性マーカー発現。 スケールバー、50μm。
d,e,Fgf4誘導幹細胞培養からFgf4を除去した効果。 Fgf4の非存在下で大きな多能有核細胞（矢印）を形成する栄養膜幹細胞（d、左）とは異なり、Fgf4誘導性幹細胞（d、右）はFgf4を除去すると、単に増殖を停止し、徐々に死亡した。 スケールバー、50μm。 この知見は、インビボでのFgf4誘導幹細胞の胎盤分化は、単にFgf4シグナルの抑制以上のものを含む可能性があることを示唆している。 　　　e、4Nおよび8N細胞の数は、栄養膜幹細胞においてFgf4の除去から6日間まで増加したが、Fgf4誘導性幹細胞では増加しなかった。


(英文)
3. Extended Data Figure 3: Transcriptome analyses of STAP cells shown by heat maps. (494 KB)
a, Heat maps of expression profiles of top-ranked up- and downregulated genes in STAP cells (Oct4-GFP+ clusters converted from CD45+ cells) compared to ES cells. Their respective expression levels in STAP stem cells, trophoblast stem cells and Fgf4-induced stem cells are shown. Absolute expression values are scaled by log2. The genes expressed differentially between ES cells and STAP cells tended to show more similar expression profiles to ES cells in STAP stem cells and Fgf4-induced stem cells than in trophoblast stem cells. Expression of some early endodermal lineage genes such as Gata4 and Sox17 was moderately elevated in STAP cells as compared to ES cells, whereas its biological significance remains elusive (these genes are shown to be strongly expressed in Oct4-GFP-dim cells1). b, Heat maps of expression profiles of top-ranked up- and downregulated genes in ES cells compared to CD45+ cells and their respective expression levels in STAP cells.
The genes expressed differentially between CD45+ and ES cells tended to show similar expression profiles in ES cells and STAP cells. c, Heat maps of expression profiles of representative genes implicated in haematopoietic lineage development in CD45+, ES and STAP cells. No strong correlation was seen between CD45+ cells and STAP cells in their expression profiles (a similar tendency of no correlation was seen for the data in b).



拡張データ図3：ヒートマップ<翻訳機訳注:個々の値のデータ行列を色として表現した可視化グラフ>によって示されるSTAP細胞のトランスクリプトーム<翻訳機訳注:特定の状況下において細胞中に存在する全てのmRNA（ないしは一次転写産物、 transcripts）の総体を指す呼称>解析。 （494 KB）
a,ES細胞と比較した、STAP細胞（CD45陽性細胞から変換されたOct4-GFP陽性クラスター）における上位ランクのアップ或いはダウンレギュレート<翻訳機訳注：転写物の増減により製造蛋白質の量が増減する>された遺伝子の発現プロファイルのヒートマップ。 STAP幹細胞、栄養膜幹細胞およびFgf4誘導幹細胞のそれぞれの発現レベルが示されている。 発現の絶対値はlog2(翻訳機訳注:Excel関数用語で2を底とする対数の意、数学定義の常用対数、自然対数のLog2ではない。)でスケールされている(翻訳機訳注:横の色分けバー)。ES細胞とSTAP細胞との間の遺伝子発現の違いは、STAP幹細胞と栄養膜幹細胞よりも、STAP幹細胞とFgf4誘導幹細胞に、より類似した発現プロファイルを示す傾向があった。 Gata4およびSox17のようないくつかの初期内胚葉系遺伝子の発現は、ES細胞と比較してSTAP細胞では適度に上昇したが、その生物学的意義は依然として分かっていない（これらの遺伝子はOct4-GFP弱発現細胞で強く発現することが示されている）。　　　 b,CD45 陽性細胞と比較した、ES細胞におけるトップランクのアップ或いはダウンレギュレートされた遺伝子の発現プロファイルのヒートマップおよびSTAP細胞のそれらに対応する発現レベル。
CD45 陽性細胞とES細胞との間の発現遺伝子の違いはSTAP細胞においても同様の傾向があった。 　　　c,CD45陽性、ES細胞およびSTAP細胞における造血系統発生に関与する代表的遺伝子の発現プロファイルのヒートマップ。 CD45陽性細胞とSTAP細胞との間には、その発現プロファイルにおいて強い相関は見られなかった（bのデータについても同様の傾向は見られなかった）。


(英文)
4. Extended Data Figure 4: Transcriptome analyses for genes implicated in cell-cycle control and induced pluripotent stem-cell conversion. (452 KB)
a, Comparison of expression values of genes involved in cell-cycle control in ES and STAP cells; the G to M cell cycle phases (upper), the cell cycle checkpoint and cell cycle arrest (middle), and the cell cycle regulation (bottom) are shown. Expression level was measured by log2 of mean normalized counts. b, Heat map for upregulated genes in cells undergoing reprogramming by ‘Yamanaka factors’[14]. c, Heat maps for upregulated genes in pre-iPS cells[15] (top) and in partially reprogrammed cells by Yamanaka factors (bottom)[14]. Expression level was measured by log2 of mean normalized counts. Differentially expressed genes were identified by the DESeq package[21] and only genes with a false discovery rate of 1% were selected for comparison, unless mentioned otherwise.


拡張データ図4：細胞周期制御および誘導された多能性幹細胞変換に関与する遺伝子のトランスクリプトーム解析。 （452 KB）
a,ES及びSTAP細胞における細胞周期制御に関与する遺伝子の発現値の比較; GからM細胞周期相(翻訳機訳注:細胞分裂のG0,G1,S,G2,Mの各段階)（上）、細胞周期チェックポイントおよび細胞周期停止段階（中）および細胞周期調節段階（下）が示されている。 発現レベルは平均正規化カウントのlog2によって測定されている。 　　　b,「Yamanaka因子」[14]によって再プログラミングされている細胞におけるアップレギュレートされた遺伝子のヒートマップ。 　　　c,pre-iPS細胞[15]（上）およびYamanaka因子[14]（下）による部分的に再プログラムされた細胞におけるアップレギュレートされた遺伝子のヒートマップ。 発現レベルは平均正規化カウントのlog2によって測定されている。。 示差的に発現された遺伝子は、DESeqパッケージ[21]によって同定され、他に言及されない限り、誤発見率1％の遺伝子のみが比較のために選択された。


(英文)
5. Extended Data Figure 5: Responses of Fgf4-induced stem cells to signal modifications. (333 KB)
a–f, JAK inhibitor treatment assay for Fgf4-induced stem cells. Fgf4-induced stem cells were cultured under feeder-free conditions and treated with 0.6 μM JAK inhibitor for 48 h. JAK inhibitor treatment assay eliminated ES cells (Oct4-GFP+) from the culture (a, b). The level of Oct4-GFP expression in Fgf4-induced stem cells, which was moderate, was maintained even after JAK inhibitor treatment (c, d; three independent experiments). Scale bar, 100 μm. e, f, For an additional control, Fgf4-induced stem cells were plated in trophoblast stem-cell medium containing Fgf4 together with Oct4-GFP ES cells that constitutively expressed BFP (the number of plated cells was one-tenth of that of plated Fgf4-induced stem cells). Whereas BFP-expressing colonies (ES-cell-derived) still expressed Oct4-GFP in trophoblast stem-cell culture medium after 2 days (e), no Oct4-GFP+ colonies from BFP-expressing ES cells were observed in the JAK-inhibitor-treated culture (f).
g, FACS analysis of integrin α7 expression in Fgf4-induced stem cells. Over 40% of Fgf4-induced stem cells strongly expressed both the pluripotency marker Oct4-GFP and the trophoblast marker integrin α7. The bottom panel shows an isotype control for integrin α7 antibody. In ES cells, integrin-α7-expressing cells were less than 0.1% (data not shown; three independent ES cell lines were examined).


拡張データ図5：Fgf4誘導幹細胞のシグナル修飾に対する反応。 （333 KB）
a-f,Fgf4誘導幹細胞に関するJAK阻害剤処理実験。 Fgf4誘導幹細胞をフィーダー細胞無しで培養し、0.6μMのJAK阻害剤で48時間処理した。 JAK阻害剤処理実験は、ES細胞（Oct4-GFP 陽性）を培養物（a、b）から除去した。 Fgf4誘導幹細胞におけるOct4-GFP発現のレベルは、中等度ではあるが、JAK阻害剤処理後でも（c、d; 3回の独立した実験）維持された。 スケールバー、100μm。　　e,f, 加えて別のコントロール実験として、Fgf4誘導性幹細胞を、Oct4-GFPとともにBFPを恒常的に発現する ES細胞（播種細胞数はFgf4誘導幹細胞数の数の1/10）と共にFgf4を含有する栄養膜幹細胞培地に播種した。　　　　　　BFPを発現するコロニー（ES細胞由来）が2日後に栄養膜幹細胞培養培地中でOct4-GFPを依然として発現した（e）のに対して、BFP発現ES細胞由来のOct4-GFP 陽性コロニーはJAK阻害剤添加培地では観察されなかった(f）。
g,Fgf4誘導幹細胞のインテグリンα7発現のFACS解析。 Fgf4誘導幹細胞の40％以上が多能性マーカーであるOct4-GFPおよび栄養膜マーカーであるインテグリンα7の両方を強力に発現した。 下のパネルは、インテグリンα7抗体のアイソタイプコントロールを示す。 ES細胞では、インテグリンα7発現細胞は0.1％未満であった（データは示していない; 3つの独立したES細胞株を調べた）。


(英文)
6. Extended Data Figure 6: Characterization of ES-like cells converted from Fgf4-induced stem cells and comparison of STAP cells with early embryos. (316 KB)
a, Immunohistochemistry of ES-like cells for trophoblast and pluripotency markers. ES-like cells converted from Fgf4-induced stem cells no longer expressed the trophoblast marker (integrin alpha 7), but they did express the pluripotency markers (Oct4, Nanog and SSEA-1). Scale bar, 100 μm. b, Pluripotency of ES-like cells converted from Fgf4-induced stem cells as shown by teratoma formation. Those cells successfully formed teratomas containing tissues from all three germ layers: neuroepithelium (left, arrow indicates), muscle tissue (middle, arrow indicates) and bronchial-like epithelium (right). Scale bar, 100 μm. c, MEK inhibitor treatment assay for Oct4-gfp Fgf4-induced stem cells in trophoblast stem-cell medium containing Fgf4. No substantial formation of Oct4-GFP+ colonies was observed from dissociated Fgf4-induced stem cells in MEK-inhibitor-containing medium. Scale bar, 100 μm.
d, Cluster tree diagram from hierarchical clustering of global expression profiles. Red, AU P values. As this analysis included morula and blastocyst embryos from which only small amounts of RNA could be obtained, we used pre-amplification with the SMARTer Ultra Low RNA kit for Illumina Sequencing (Clontech Laboratories). e, f, Volcano plot of the expression profile of STAP cells compared to the morula (e) and blastocyst (f). Genes showing greater than 10-fold change and P value 1.0 × 10(to the power of－6 )are highlighted in red and are considered up- (or down-) regulated in the STAP cells.



拡張データ図6：Fgf4誘導幹細胞から変換されたES様細胞の特徴付けおよびSTAP細胞と初期胚との比較。 （316 KB）
a,栄養膜マーカーおよび多能性マーカーに関するES様細胞の免疫組織化学。Fgf4誘導幹細胞から変換されたES様細胞は、栄養膜マーカー (integrin alpha 7)をもはや発現しなかったが、それらは多能性マーカー（Oct4、NanogおよびSSEA-1）を発現した。スケールバー、100μm。　　　b,テラトーマ形成によって示されたFgf4誘導幹細胞から変換されたES様細胞の多能性。これらの細胞は三胚葉すべてからの組織を含むテラトーマをきれいに形成した:神経上皮（左、矢印が示す）、筋肉組織（中、矢印が示す）および気管支様上皮（右）。 スケールバー、100μm。　　　 c,Fgf4を含有する栄養膜幹細胞培地中のOct4-gfp陽性Fgf4誘導幹細胞に対するMEK阻害剤処理実験。 MEK阻害剤含有培地中の解離したFgf4誘導細胞から、Oct4-GFP陽性コロニーの実質的な形成は観察されなかった。 スケールバー、100μm。
d、グローバルな発現プロファイルの階層的クラスタリングによるクラスタツリー図。 赤、AU P値。 この分析には、少量のRNAしか得られない桑実胚および胚盤胞胚が含まれていたため、Illumina Sequencing（Clontech Laboratories）用のSMARTer Ultra Low RNAキットでプレ増幅を行った。 　　　e,f,桑実胚（e）および胚盤胞（f）と比較したSTAP細胞の発現プロフィールの火山プロット。 10倍を超える変化およびP値1.0×10マイナス6乗を示す遺伝子は赤色で強調表示され、STAP細胞において上方（または下方）に調節されると考えられる。


<サプリテーブルは省略 >

1. 2019/05/14(火) 09:33:49|
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