一言居士の独言

(英文)
STAP stem-cell conversion culture
1. To establish STAP stem-cell lines, STAP cell clusters were transferred to ACTH-containing medium on MEF feeder cells (several clusters, up to a dozen clusters, per well of 96-well plates).
IMPORTANT
(i) ACTH (1-24) is available from American Peptide and other companies. We used ACTH synthesized by Kurabo on consignment. The composition of this medium is GMEM, 15% Knockout Serum ReplacementTM (KSR, Invitrogen), 1 × non-essential amino acids (NEAA), 1 × Sodium Pyruvate, 10-4M 2-mercaptoethanol, 1000 U/ml LIF, and 10 µM ACTH . The STAP cell cluster was isolated, dissected into small pieces as in the case of injection into blastocysts as shown in Figure 4a (Obokata et al. Nature, 2014a), and seeded on mouse embryonic fibroblast feeder cells in the ACTH medium.
(ii) ACTH-containing medium was purchased from DS Pharma Biomedical (Osaka, Japan) as StemMedium@.

STAP幹細胞変換培養
1. STAP幹細胞株を確立するために、 STAP細胞クラスターはMEFフィーダー細胞上のACTH含有培地に移される。（96ウェルプレートの1ウェルあたり１ダースまでの複数のクラスタ）
[重要]
(i)ACTH（1-24）は、アメリカンペプチド社および他の会社から入手可能である。我々は委託契約でクラボウによって合成されたACTHを使用していた。この培地の組成は、GMEM、15％ノックアウト血清代替TM（KSR、Invitrogen社）、1×非必須アミノ酸（NEAA）、1×ピルビン酸ナトリウム、10 -4 M2-メルカプトエタノール、1000U / mlのLIF、および10μM　ACTHである　(Ogawa et al, Genes Cells, 2004)。 STAP細胞のクラスターは図4a (Obokata et al. Nature, 2014a)にしめされた胚盤胞注入の場合のように単離され小片に切開され、ACTH培地中のマウス胚線維芽細胞フィーダー細胞上に播種された。
(ii)ACTH含有培地はステムミージャムアドレスのDSファーマバイオメディカル社（大阪、日本）から購入されている。


(英文)
2. After 4–7 days of culture, the cells were subjected to a first passage using a conventional trypsin method, and the suspended cells were plated in ESC maintenance medium containing 20% FBS.
IMPORTANT
(i) ESC maintenance medium consists of KnockoutTM DMEM (Life Technologies), 20% FBS, 1 × NEAA, 1 × Glutamine, 1 × Nucleosides, 10-4M 2-mercaptoethanol, and 1000 U/ml LIF.
(ii) FBS lots should be confirmed for suitability for use in the culture of mouse ES cells.
(iii) We have established multiple STAP stem cell lines from STAP cells derived from CD45+ haematopoietic cells. Of eight clones examined, none contained the rearranged TCR allele, suggesting the possibility of negative cell-type-dependent bias (including maturation of the cell of origin) for STAP cells to give rise to STAP stem cells in the conversion process. This may be relevant to the fact that STAP cell conversion was less efficient when non-neonatal cells were used as somatic cells of origin in the current protocol.


2.　培養の4から7日後に、細胞は従来のトリプシン法を使って第一段階に供され、懸濁した細胞を、20％FBS＜ウシ胎児血清　fetal bovine serum＞を含むES細胞維持培地に蒔種された。
[重要]
（i）ES細胞維持培地は KnockoutTM DMEM＜イーグル最小必須培地＞（Life Technologies社）、20％FBS、1×NEAA、1×グルタミン、1×ヌクレオシド、10 -4M　2-メルカプトエタノール及び1000 U/mlのLIFから構成されている。
（ii）のFBSロットは、マウスES細胞の培養に使用するための適合性が確認されるべきである。
（ⅲ）我々はCD45陽性造血細胞に由来するSTAP細胞から複数のSTAP幹細胞株を確立している。調べた8個のクローンのうちのいずれも再構成されたTCR対立遺伝子を含んでいなかった。このことはSTAP細胞が変換プロセスでSTAP幹細胞になるための、（もとの細胞の突然変異含む）陰性の細胞型依存バイアスの可能性を示唆している。これは現在のプロトコルにおいて、非新生細胞をもとの体細胞として使用したときに、STAP細胞の変換がそれほど効率的でなかったという事実に関係しているかも知れない。


(英文)
3. Subsequent passaging was performed at a split ratio of 1:10 every second day until reaching subconfluency. We tested the following three different genetic backgrounds of mice for STAP stem-cell establishment from STAP cell clusters, and observed reproducible establishment: C57BL/6 carrying Oct4-gfp (29 of 29), 129/Sv carrying Rosa26-gfp (2 of 2), and 129/Sv × C57BL/6 carrying cag-gfp (12 of 16). STAP stem cells with all these genetic backgrounds showed chimaera-forming activity.


3.　その後の継代はサブコンフルエント（シャーレ一杯になる前）に達するまでの二日置きに、1対10の分割比で行なった。我々はSTAP細胞クラスターからSTAP幹細胞を樹立するために、マウスの以下の3つの異なる遺伝的背景をテストし、再現性の確立を観察した。Oct4-GFP（29の29）を持つC57BL/6、Rosa26-GFP（2の2）をもつ129/ SV、および129/ CAG-GFP（16の12）をもつSV×C57BL/6。すべてのこれらの遺伝的背景を持つSTAP幹細胞はキメラ形成活性を示した。



(英文)
FI stem cell conversion culture
1. STAP cell clusters were transferred to Fgf4-containing trophoblast stem-cell medium (Tanaka et al, Science, 1998) on MEF feeder cells in 96-well plates (Obokata, Nature, 2014b).
IMPORTANT
(i) TS medium consists of RPMI 1640 with 20% FBS, 1 mM Sodium Pyruvate, 100 µM 2-mercaptoethanol, 2 mM L-glutamine, 25 ng/ml of recombinant FGF4, and 1 µg/ml of heparin.
(ii) Different lots of FBS may results in significant differences in the behavior of cultured cells.
2. In most cases (40 of 50 experiments), colonies grew in 10–50% of wells in 96-well plates. In a minority of cases (10 of 50 experiments), no colony growth was observed and/or only fibroblast-like cells appeared.
IMPORTANT
(i) The cells in proliferative colonies also appear similar to fibroblasts, but gradually change morphology, coming to resemble epithelial cells.


FI幹細胞変換培養
1. STAP細胞クラスターがFGF4を含む96ウェルプレート中のMEFフィーダー細胞上のＴＳ細胞＜栄養芽層幹細胞＞培地 (Tanaka et al, Science, 1998)に移される (Obokata, Nature, 2014b)。
[重要]
（i）TS培地は20％のFBS＜ウシ胎児血清＞を含むRPMI1640＜ロズウェルパーク記念研究所培地　Roswell Park Memorial Institute medium＞、1mMのピルビン酸ナトリウム、100μMの2-メルカプトエタノール、2mMのL-グルタミン、組換えFGF4の25 ng / ml及びヘパリンの1μg/mlで構成されている。
(ii)FBSのロットの違いは培養細胞の挙動に重大な差異をもたらしうる。
2.　ほとんどの場合（50回のうちの40回の実験）、コロニーは96ウェルプレートのウェルの10から50％までに成長した。少数の例（50のうちの１０回の実験）では、全くコロニー増殖が観察されずに、かつ/または、わずかの線維芽細胞様細胞が出現した。
重要
(i)増殖コロニー内の細胞はまた線維芽細胞のように現れるが、徐々に形態を変更して上皮細胞に似てくる。


(英文)
3. The cells were subjected to the first passage during days 7–10 using a conventional trypsin method. Subsequent passages were performed at a split ratio of 1:4 every third day before they reached subconfluency.
IMPORTANT
The cells must not be dissociated completely. Partial dissociation is optimal to maintain viability and self-renewal, as seen in the case of embryo-derived trophoblast stem cells.

3.　細胞を従来のトリプシン法を用いて7-10日間の最初の継代に供した。それらがサブコンフルエントに達する前に３日おきに４対１の分割比でその後の継代を行った。
[重要]
(i) 細胞は完全に解離されてはいけない。胚由来のトロホブラスト幹細胞の場合に見られるように、部分的な解離が生存能力および自己再生を維持するのに最適である。



(英文)
References
Obokata, H. et al.Obokata.　Stimulus-triggered fate conversion of somatic cells into pluripotency, Nature, 505, 641-647 (2014a)
Obokata, H. et al. Bidirectional developmental potential in reprogrammed cells with acquired pluripotency. 676–680 (2014b)
Ohbo, K. et al. Identification and characterization of stem cells in prepubertal spermatogenesis in mice small star, filled. Dev. Biol. 258, 209–225 (2003)
Yoshimizu, T. et al. Germline-specific expression of the Oct4/green fluorescent protein (GFP) transgene in mice. Dev. Growth. Differ. 6, 675-684 (1999)
Ogawa, K., Matsui, H., Ohtsuka, S. & Niwa, H. A novel mechanism for regulating clonal propagation of mouse ES cells. Genes Cells 9, 471–477 (2004)
Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A. & Rossant, J. Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4. Science 282, 2072–2075 (1998)


＜参照＞
Obokata, H. et al.Obokata.　『体細胞の多能性への刺激惹起性運命変換』Nature, 505, 641-647 (2014a)
Obokata, H. et al.　『取得多能性を持つ再プログラム細胞における双方向への発生能力』 676–680 (2014b)
Ohbo, K. et al.　『マウスの小さな星の中に満たされた思春期前の精子形成における幹細胞の同定と特徴づけ』　Dev. Biol. 258, 209–225 (2003)
Yoshimizu, T. et al.　『マウスのOct4/緑色蛍光タンパク質（GFP）導入遺伝子の生殖細胞特異的発現』　Dev. Growth. Differ. 6, 675-684 (1999)
Ogawa, K., Matsui, H., Ohtsuka, S. & Niwa, H.　『マウスES細胞のクローン増殖を調節するための新しいメカニズム』　Genes Cells 9, 471–477 (2004)
Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A. & Rossant, J.　『FGF4＜線維芽細胞増殖因子＞によるＴＳ細胞増殖の推進』　Science 282, 2072–2075 (1998)


(英文)
Associated Publications
This protocol is related to the following articles:
Stimulus-triggered fate conversion of somatic cells into pluripotency
Haruko Obokata, Teruhiko Wakayama, Yoshiki Sasai, Koji Kojima, Martin P. Vacanti, Hitoshi Niwa, Masayuki Yamato, and Charles A. Vacanti
Journal title
Nature
Vol.
505
Issue
-7485
Pages
641 - 647
Publication date
29/01/2014
DOI:
doi:10.1038/nature12968


＜関連著作物＞
このプロトコルは下記論文に関連している。
『体細胞の多能性への刺激惹起性運命変換』
Haruko Obokata, Teruhiko Wakayama, Yoshiki Sasai, Koji Kojima, Martin P. Vacanti, Hitoshi Niwa, Masayuki Yamato, and Charles A. Vacanti
Journal title
Nature
Vol.
505
Issue
-7485
Pages
641 - 647
Publication date
29/01/2014
DOI:
doi:10.1038/nature12969



(英文)
Bidirectional developmental potential in reprogrammed cells with acquired pluripotency
Haruko Obokata, Yoshiki Sasai, Hitoshi Niwa, Mitsutaka Kadota, Munazah Andrabi, Nozomu Takata, Mikiko Tokoro, Yukari Terashita, Shigenobu Yonemura, Charles A. Vacanti, and Teruhiko Wakayama
Journal title
Nature
Vol.
505
Issue
-7485
Pages
676 - 680
Publication date
29/01/2014
DOI:
doi:10.1038/nature12969


『取得多能性を持つ再プログラム細胞における双方向への発生能力』
Haruko Obokata, Yoshiki Sasai, Hitoshi Niwa, Mitsutaka Kadota, Munazah Andrabi, Nozomu Takata, Mikiko Tokoro, Yukari Terashita, Shigenobu Yonemura, Charles A. Vacanti, and Teruhiko Wakayama
Journal title
Nature
Vol.
506
Issue
-7484
Pages
677 - 680
Publication date
29/01/2015
DOI:
doi:10.1038/nature12970


(英文)
Author Information
Affiliations
1. Laboratory for Cellular Reprogramming, RIKEN CDB
Haruko Obokata
2. Laboratory for Organogenesis and Neurogenesis, RIKEN CDB
Yoshiki Sasai
3. Laboratory for Pluripotent Stem Cell Studies, RIKEN CDB
Hitoshi Niwa
Competing financial interests
The authors declare no competing financial interests.
Corresponding author
Correspondence to:
Hitoshi Niwa (niwa@cdb.riken.jp)


＜著者紹介＞
［所属］
1.細胞リプログラミング研究室、理研CDB
小保方晴子
2.器官発生・神経発生研究室、理研CDB
笹井芳樹
3.多能性幹細胞解明研究室、理研CDB
丹羽仁
［金銭的利益相反］
著者等は金銭的利益相反のないことを宣誓します。
［責任著者］
連絡はこちらへ
Hitoshi Niwa (niwa@cdb.riken.jp)

1. 2019/05/14(火) 08:24:42|
2. プロトコル
4. | コメント:0