一言居士の独言

【００３０】
以下に実施例を示して本発明を具体的かつ詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものと解してはならない。
【実施例】
【００３１】
Ａ．倍化ＥＳマウスの出産率の比較
本実験の目的は、複数の４倍体胚を用いることによりＥＳマウスの作成効率の向上を図ることである。そのためにまず、正常胚を用いて、倍化胚（３ｘおよび５ｘ）を作成し、その発生能を解析した。その結果、３ｘ正常胚では正常な範囲内で産仔を得ることに成功したが（５０％；８／１６）、５ｘ正常胚からは産仔を得るにいたらなかった（０％；０／８）。以上の結果から、過剰な胚の数は発生能を障害することが示唆された。この結果を元に本実験では１ｘから３ｘの４倍体胚とＥＳ細胞のキメラ胚を作成し、ＥＳマウスの出産率を比較検討した。

【００３２】
Ｂ．倍化４倍体胚の細胞数の解析
ＥＳマウスの作成の前に、まず、倍化した４倍体胚の細胞数が実際に増加しているのかを検討した。授精後９６時間の１ｘから３ｘの４倍体胚をそれぞれ１０個ずつＰＩとＣｄｘ２の２重染色を行った。以前の報告（Koizumi N, Fukuta K. Preimplantation development of tetraploid mouse embryo produced by cytochalasin B. Exp Anim. 1995;44(2):105-109）と一致して、１ｘ４倍体胚では正常胚（１ｘ２ｎ）と比較して総細胞数の減少が認められた（表１および図１Ａ－Ａ”、Ｄ－Ｄ”）。一方で、２ｘ４倍体胚および３ｘ４倍体胚では、総細胞数の増加が確認された（表１および図１Ｂ－Ｂ”、Ｃ－Ｃ”）。これらの２ｘ４倍体胚および３ｘ４倍体胚では、ＴＥ細胞数およびＩＣＭ細胞数もそれぞれ増加していることが示された（表１）。また、３ｘ４倍体胚を抗Ｏｃｔ３／４抗体で免疫染色したところ、正常にＩＣＭ細胞が染色された（図１Ｅ－Ｅ”）。以上の結果から、胚盤胞期の倍化４倍体胚では、予想通り細胞数が増加しており（表１）、ＩＣＭなどへの分化も正常に行われることが証明された（図１Ｅ－Ｅ”）。
（表１．倍化４倍体胚の細胞数の解析）
【表１】

【００３３】
Ｃ．倍化４倍体胚を用いたＥＳマウスの作成効率の検討
先の実験で倍化４倍体胚の細胞数の増加が確認されたので、次にＥＳマウスの作成効率の検討を行った。使用したＥＳ細胞は、一般的なＥＳ細胞株であるＥ１４、ｎｔＥＳ細胞として１２９Ｂ６Ｆ１Ｇ１（ＧＦＰ陽性）およびＢＤｍｔ２、ならびに近交系由来のＥＳ細胞株としてＤＦＣ３Ｈ（合計１０株をランダムに使用）を用いた。図２に示したように、ＧＦＰを発現する１２９Ｂ６Ｆ１Ｇ１を用いてキメラ胚を作成したところ、３ｘ４倍体胚にＥＳ細胞が正常に取り込まれることが示された（図２Ｄ－Ｆ）。
【００３４】
次に、各ＥＳ細胞と１ｘないし３ｘの４倍体胚とのキメラ胚を作成し、胚移植後の発生能の検討を行った。１ｘおよび２ｘ４倍体胚をホスト胚として用いた場合では、３系統のＥＳ細胞（Ｅ１４、１２９Ｂ６Ｆ１Ｇ１およびＢＤｍｔ２）は、ＥＳマウスの作成効率が約１－３％と非常に低頻度であった（表２）。一方、３ｘ４倍体胚を用いた場合では、その作成効率が約２．５－８．５倍に向上した（８．６％：表２）。また、従来作成が困難と考えられていた近交系由来のＥＳマウスでも、３ｘ４倍体胚を用いることにより約７％の成功率で作成可能であることが示された（表２）。
【００３５】
以上の結果から、２ｘ４倍体胚では正常胚と同程度の細胞数を有するが（表１）、ＥＳマウスの作成効率は、３ｘ４倍体胚を使用したものが最も効率がよく（表２）、従来法の１ｘもしくは２ｘ４倍体胚では不十分であることが示された。
（表２．倍化４倍体胚を用いたＥＳマウスの作成効率の検討）
【表２】

*:E14;一般的に用いられているES細胞。129B6F1G1およびBDmt2;ntES細胞。DFC3H;近交系由来ntES細胞。

【００３６】
Ｄ．倍化４倍体胚より作成された新生仔ＥＳマウスの解析
ＥＳマウスは奇形仔の頻度が高いことが知られているので、次に３ｘ４倍体胚より作成されたＥＳマウスの表現型を観察した。３ｘ４倍体胚由来のＥＳマウスは、体重・胎盤重量とも１ｘまたは２ｘ４倍体胚由来のＥＳマウスと同程度であった（表３）。また開眼・腹部ヘルニア・巨大産仔の出現率なども差は認められなかった（表３）。以上の結果から、３ｘ４倍体胚を用いた場合であってもＥＳマウスの奇形頻度は、少なくとも従来のＥＳマウスと同程度であることが示された。

【００３７】
ＥＳマウスの最大の特徴は、体を構成しているほぼ全ての細胞がＥＳ細胞由来であるという点である。表１に示したように、３ｘ４倍体胚では、総細胞数のみならず、体を構成しうるＩＣＭ細胞も増加している。最後に、３ｘ４倍体胚由来のＥＳマウスが実際にＥＳ細胞由来の細胞で構成されているかを検討した。
【００３８】
ホストである４倍体胚由来の細胞とＥＳ細胞を区別するため、ＥＳ細胞にはＥ１４、ホストにはＩＣＲＧＦＰ由来の４倍体胚を使用した。このことにより、４倍体胚由来の細胞がＧＦＰを発現するため、ＥＳマウスにて４倍体由来の細胞を容易に確認することが可能となる。この方法を用いて、３ｘ４倍体胚から合計１５匹のＥＳマウスを作成し、蛍光顕微鏡を用いて観察を行った。図３に示すように、得られた１５匹すべてにおいて、胎盤でＧＦＰが発現し、産仔では発現していなかった（図３Ａ－Ｃ）。これらの結果から、３ｘ４倍体胚を使用してもＥＳマウスに４倍体胚由来の細胞が大きく混入する可能性は低いと考えられる。次に、より詳細な解析を行うため、フローサイトメトリーによるＧＦＰ細胞の検出を行った。１ｘおよび３ｘ４倍体胚より作成したＥＳマウスをそれぞれ２匹ずつ使用し、脳および肝臓におけるＧＦＰ陽性細胞を検出した。解析の結果、１ｘおよび３ｘ４
【００３９】
倍体胚由来のＥＳマウスとも、４倍体胚由来のＧＦＰ細胞の混入率は１％未満であった。
以上の結果から、３ｘ４倍体胚を用いたＥＳマウスは、従来法に由来するＥＳマウスと同様に、ほぼ全ての構成細胞がＥＳ細胞由来であることが証明された。
（表３、ＥＳマウスの表現型の解析）
【表３】

a平均±SD(g)。
bOE:開眼、AH:腹部ヘルニア、LO:巨大産仔、OELO:開眼および巨大産仔を併発した仔、OEAH:開眼および腹部ヘルニアを併発した仔。

【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明は、トランスジェニック動物やノックアウト動物のごとき遺伝子改変非ヒト動物を効率的に作成する方法およびこの方法により作成された遺伝子改変非ヒト動物を提供する。そのため、病理学的な研究や新治療法の開発に用いる実験動物の製造、新薬の開発をはじめとする多くの産業分野において利用可能である。

【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１は、倍化４倍体胚の細胞数の解析結果を示す。Ａ－Ｅは１ｘから３ｘ４倍体胚および正常胚（１ｘ２ｎ）をＰＩ染色した写真、Ａ’－Ｄ’は１ｘから３ｘ４倍体胚および正常胚（１ｘ２ｎ）をＣｄｘ２で免疫染色した写真、Ａ”－Ｄ”はそれぞれの写真を合成した写真である。Ａ－Ａ”は１ｘ４倍体胚、Ｂ－Ｂ”は２ｘ４倍体胚、Ｃ－Ｃ”は３ｘ４倍体胚、Ｄ－Ｄ”は正常胚（１ｘ２ｎ）、Ｅ－Ｅ”は３ｘ４倍体胚をＰＩ（Ｅ）、Ｏｃｔ３／４ （Ｅ’）で染色した写真、およびその合成写真をＥ”として示した。スケールバー：Ａ”－Ｄ”１００μｍ。Ｅ”２００μｍ。
【図２】図２は、１２９Ｂ６Ｆ１Ｇ１を用いた４倍体胚とのキメラ胚の作成を示す。Ａ－Ｃは１ｘ４倍体胚とＥＳ細胞（１２９Ｂ６Ｆ１Ｇ）のキメラ胚、Ｄ－Ｆは３ｘｘ４倍体胚とＥＳ細胞（１２９Ｂ６Ｆ１Ｇ）のキメラ胚を示す。Ａ、Ｄは可視光写真、Ｂ、Ｅは蛍光写真、Ｃ、Ｆはそれぞれの合成写真である。スケールバー：２００μｍ。
【図３】図３は、３ｘ４倍体胚から作出されたＥＳマウスの解析である。（Ａ－Ｃ）ＧＦＰを発現する３ｘ４倍体胚とＥ１４ ＥＳ細胞を用いたＥＳマウスである。（Ａ）可視光写真を示す。（Ｂ）蛍光写真を示す。（Ｃ）ＡとＢの合成写真を示す。胎盤においてのみ４倍体胚由来（ＧＦＰ陽性）の細胞が確認される。（Ｄ、Ｅ）フローサイトメトリーによる解析結果である。１ｘ４倍体胚由来のＥＳマウス（Ｄ）および３ｘ４倍体胚由来のＥＳマウス（Ｅ）の脳（左パネル）および肝臓（右パネル）におけるＧＦＰ陽性細胞の存在頻度を解析した。１ｘおよび３ｘ４倍体胚由来のＥＳマウスともＧＦＰ陽性細胞の存在頻度は１％未満であった。

【出願人】
【識別番号】５０３３５９８２１
【氏名又は名称】独立行政法人理化学研究所

【出願日】
平成２０年１月４日（２００８．１．４）

【代理人】
【識別番号】１０００８１４２２
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 光雄

【識別番号】１０００８４１４６
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 宏

【識別番号】１００１１６３１１
【弁理士】
【氏名又は名称】元山 忠行

【識別番号】１００１２２３０１
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史

【公開番号】
特開２００９－１５９８７８（Ｐ２００９－１５９８７８Ａ）

【公開日】
平成２１年７月２３日（２００９．７．２３）

【出願番号】
特願２００８－８９（Ｐ２００８－８９）

1. 2019/05/14(火) 11:31:47|
2. 非ヒトＥＳ動物
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