一言居士の独言

[連投1]
>>Ts.Markerさん
私はIGVの見方がわかりません。濃く出ていれば発現が多い、薄いのは少ないという素人感覚で〇X△と認識して分類しています。要望です。まず、今回のHH,H,X,N/A,L,LLの意味を解説してください。次に、Tru-seq, SMARTer, ChIP-seqの区別を教えてください。特に前者二つはどちらもRNASeqと書かれていて、どう違うのかがわかりません。たぶん、どちらかが2012年8月の分析で、他方が2013年1月以降の分析でくわえられたのかとも推測しますが分かりません。それから細胞種はES,STAP,STAP-SC,FI-SC,TSと分類されていますが、あなたの分析したライン別に記載されてください。

[連投2]
このデータはあなたしかお持ちでない(アルイミオウジ氏のところにもありますが)。我々はあなたのブログに出ているものだけしか把握していません。現在どれだけ分析が進んでいるのかは存じませんが、新しく加えられているデータがあったらそれも更新していただければ有難いです。我々が今持っているデータは、
Tru-seq=ES560,STAP580,STAP-SC585,FI-SC565,TS590,EpiSC568,CD45+556
SMARTer=ES574,STAP578(Bowtie2,TopHat2)
SMARTer=STAP581(Sox21のみ)
ChIP-seq=ES563,STAP583,STAP-SC588,FI-SC568,TS593
ChIP-seq<やっぱりね>=FI-SC567,FI-SC568,FI-SC569
です。番号は560→SRR1171560の意味です。

[連投3]
ご承知の通り、このデータの整理は相当の混乱があって、2年間のデータを合わせて整理されていて、かつ、いつ誰がどういう経緯で登録したのかもわかっていません。例えばF1の細胞はすべてがC57BL/6x129/Svと記載されているんですが中身がそれぞれ全く違っている。TSもすべてCD1と書かれていて丹羽研提供は桂報告書で分かっていますが、遠藤さんが分析した590,591はB6と129が出ていて若山さんの作ったF1のTSのようです。この公共データ登録は小保方さんが一旦理研を経由して登録していて人の手が介入しているようでもあります。ライン別にちゃんと識別されていなければ後の検討に差し障る理由です。以上要望でした。



[連投1]
>>学さん
アルイミオウジ氏も気づかれていなかったですが、～10は肩の小さい3が脱落しているんです。10の三乗です。つまり～1000で、スフィア塊は最大1000個程度の細胞で構成されているという意味です。このことはスフィア塊の写真を見ればわかる通りで10個以下なんてことはあり得ませんし、球を想定して計算しても1000個程度とわかりますし、ティシュー論文以来細胞塊は約1000個の細胞でできていると書き継がれていることでもあります。誤植の類なんですけど、あの分析に丹羽さんが10個のESを基準にしていることでなんとなく曖昧に気づかずに読み過ごされていることが多いようです。

[連投2]
（図3b）は約1000個の細胞で構成されているスフィア塊を10個のES細胞のマーカー遺伝子発現量と比較したものが19例並べてあるグラフです。メモリは対数表示で、Oct4に関して言えば0.1のライン以上が4例あるということです。10個のESの発現量との比較ですから、0.1の近辺では1個分が発現しているということです。1000個の中の1個です。しかも比較的発現のある19例を並べてあるんですから、何もない事例もあるということです。1000個の19例だと19000ですが、スフィア塊は20から30個程度形成されたと書かれています。で、結果的に最大30スフィアの20%つまり最大6個のスフィアのそれぞれに1個か2個の内在性Oct4遺伝子発現があった。つまり最大12個あったという結論なんです。それは最初の50万個の細胞に対しては0.0012–0.0024%であるということですね。

[連投3]
これでもティシュー論文では試験管内三胚葉分化も足場付きテラトーマならできているわけです。それは大量に入れた細胞の中の一個でも多能性細胞であれば分化するからですね。これが今でもヴァカンティが特許申請継続している理由です。でも、相沢さんと丹羽さんの検証目的は理研の名前で出しているネイチャー論文の骨子通りに特許も申請していますから、キメラが再現できるか否かだけが検証の目的で、理研の予算を使って行っているのですから、ティシュー時の細胞が何であったかなどという検証はやれません。目的が違うということです。結果は、再現できないから特許申請は取り下げるというものです。

[連投4]
そこの理解に関して一致できれば、今度は丹羽論文の曖昧さに関しても指摘できることになると思います。ES10個分の発現量と比較して0.1は確かに1個分ですけど、これは必ずしも一個だとは言えませんよね。1/100が10個集まったら1/10です。1/1000が100個集まっても1/10です。とても微量な発現がたくさんあるという可能性を否定できていませんね。

[連投5]
（図4a）に2個のスフィア塊の中で11個のOct4発現個別細胞が免染で黄色く着色されているのが見えます。結論には6個のスフィア塊の中に1から2個だったはずですね。これは1から2個分の発現量と読み替えないといけないんでしょうね。
>>However, the frequency was very low; 5 × 10^5 liver cells yielded only ~30 cell aggregates, in which about 20% of the cell aggregates contained 1–2 Oct3/4 positive cells, indicating a frequency per seeded liver cell of 0.0012–0.0024%.

[連投6]
このことはGFPの蛍光に関しても言えるかもしれません。Ooboeさんのパートナー氏は予備的再現実験時の小保方さんの作った自家蛍光ではない沢山の蛍光細胞の出現写真をガンバレブログにアップされています。亜致死酸浴下条件でOct4-GFPが内在性Oct4遺伝子発現に正確に比例して発現するのか否かはわかっていません。こんな実験をしたのは小保方さんが初めてだからです。丹羽さんも1割程度の漏れ出しという現象を発見しています。分かってないことが多いですけど、前述した通り理研の検証実験は特許申請維持の可否検証が目的ですので多くを要求することはできませんね。事件は複雑なので、多面的に検討していくしかないと思っています。以上です。

1. 2019/06/01(土) 07:06:03|
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