一言居士の独言

[連投1]
>>学さん
>この時期の小保方氏は、STAP細胞は用意できただけかな？と思います。幹細胞実験には小保方氏は参加しておらず、若山氏から譲られた細胞しか持ち合わせていないのではないか？と想像します。

大まかにそういうことだと思います。

[連投2]
ただし、STAP細胞を作らされているということはその都度どんなマウスを渡されているかはわかっています。GRASへの解析依頼に関しては基本、長である若山さんの依頼認可が必要ですから若山さんの指示で行っていて、この手伝いを詳しい先輩(共著者の野老博士さんだと思います)が手伝ってくれたと手記では説明されています。従って小保方さんが全く関与していないということはないですね。ただ、笹井研に移ってからの分析は小保方さんが行っていて、このヒートマップは同じく共著者の門田さんの仕事ですね。笹井さんがかわいがっていた人のようです。

[連投3]
GRASからの再度サンプル提出要請はないです。彼らは提出されたものを分析するだけです。再提出しているのは笹井さんや小保方さんです。樹上図がうまく理屈どうりにならなかったからですね。丹羽さんのCD1のTSは若山さんの作ったTSが分化していたらしいという理由で提供されたものです。これは報告書に書かれています。ところが遠藤さんが分析した二つのTSラインはB6と129のF1だという結果になっている。でも登録はTSは全部CD1になっています。Ts.Markerさんの分析の記事のところにも書きましたが、この登録事務時にも何か混乱があるようだと推測しています。というのもあまりに矛盾が多いんです。

[連投4]
で、肝心のヒートマップですが、まず最初のaはSTAP細胞の全RNA発現遺伝子ですね。それに対してESとSTAP-SCとTSとFI-SCの同じ遺伝子発現がどうであるかと比較されている。STAP細胞が基準ですからこのときのSTAP細胞に例えばSox21が発現していなければ、他の細胞には発現していても項目には上がりません。そういう比較ですね。bは同様にES細胞基準です。
二つの問題があると思いますね。
①酸浴されているのはSTAP細胞だけで、GRAPDH値が他と違う。
②時々の細胞の状態によって発現RNAが変わる可能性。特にSTAP細胞はまだ確かな幹細胞であると確定していない。

[連投5]
①は相沢論文に論じられていることです。ハウスキーピング遺伝子が動いたら比較はできません。
②はキメラができたとされているから笹井さんたちが油断したんで、これがまだ博論段階の研究だったら、こんな分析は何も言えてることになりません。でも、キメラはできていて、STAP細胞は幹細胞だと、小保方さんは言うに及ばず、笹井さん、丹羽さんも含めて若山さん以外の関係者全員が信じているんです。事件は単相ではありません。以上です。
(追伸)丹羽論文記事のところにもコメントしています。こちらは受け付けられていますが、まだアップされていません。お気づきでないのかとも推測しています。





[連投1]
>>学さん
自家蛍光はいろんなスペクトルを出すので、緑色フィルターだけで見るのではなくて、赤色フィルターでも見ますね。因みにライブセルイメージングでは同時に多画面を見れるので、緑も赤も同時に確認されたら自家蛍光が混じってることだけはわかりますが、手記にある通り、小保方さんはキメラ成功前から若山研でライブセルイメージング実験をラボメンバーに手伝ってもらって自家蛍光確認も行っています。(86P)

[連投2]
実験の都合次第で自家蛍光の無いものだけを取り出すこともできるでしょうし、自家蛍光の混じっている細胞しか観察されず、加えて必要があるなら、緑色蛍光が本当に挿入マーカー遺伝子の蛍光であるかどうかは別の手段で確認できますね。
①挿入人工遺伝子の存在をPCRで確認する方法
②マーカー標的している目的のmRNA自体の存在をPCRで確認する方法
③目的のmRNAの発現結果であるタンパク質の存在を免染確認する方法
丹羽さんは取り混ぜてすべて行っていますね。

[連投3]
自家蛍光の存在は蛍光顕微鏡を見るときの初歩知識で、関連の専門家ならだれでも知っています。STAP細胞の緑色蛍光を自家蛍光だと最初にいいだしたのがノフラーさん、日本では関さんですが、若山さんの人脈ですね。ノフラーさんのブログで、誰かさんがハアイ、ポールと呼び掛けて問答があるのですが、対してTs.Markerさんの<やっぱりね>質問はガン無視されていることはご承知のとおりです。

[連投4]
>>ＧＯＦマウスでないマウス由来肝細胞を酸浴して得た細胞凝集塊では自家発光はせず、ＯｃｔｍＲＮＡと、蛋白産生が見れています。

ここは自家蛍光もあったかどうかは確認写真がありませんが、ただ、自家蛍光の無いものを使っているということでしょうね。アルブクレマウスですね。僕の勘違いは後で述べます。

[連投5]
>>ただし、Oct陽性細胞の割合は、HCl酸浴肝細胞と酸浴させていない肝細胞と同程度であり、肝細胞にはそうした細胞が含まれるか、あるいは非特異的な検査結果か？とのことのようです。

これはFigure3-aのことをおっしゃってるのだと思われますが、コントロールのES細胞ではCAG-GFP遺伝子と内在性Oct4遺伝子の発現量がそれぞれ1に設定してあり、赤と緑の棒グラフで示されていて、それに対して、GOFマウスの肝細胞を乖離した時点で既にOct4-GFPが対数スケールで7%程度発現している。ATP処理しても8%程度、HCL処理すると10%に近いという結果ですが、それに対する内在性Oct4遺伝子の発現は検出限界のゼロです。つまりGFPは光ってるが肝心の内在性Oct4遺伝子の発現はほとんど無いと言ってるわけですね。

[連投6]
これはqPCRの検証でmRNAそのものを検出しているのでもちろん自家蛍光の問題なんかとは無関係です。Oct4-GFP人工遺伝子は発現しているが、内在性のOct4蛋白質を作る遺伝子そのものは発現してないという結果ですね。丹羽さんはそのGFPの異常発現をleaky expressionと言ってますが、原因には触れていませんね。
Oct4-GFPの設計は内在性のOct4遺伝子を動かすためのプロモーターと同じものをGFP製造プログラムにつなげていますから、一方が動き出したら他方も動く仕込みです。でも生体の中でのことですから、酸浴亜致死下では双方の発現がどうなるかまでは考えられていませんよね。

[連投7](ヤフーの書込不可表示で中断してました。)
またコントロールのESのGFPはCAG-GFPです。なぜOct4-GFPマウスのESを使わなかったのか、そして、ES細胞を酸浴させるとそのOct4-GFPの発現がどうなるかをどうして確認しなかったのかという問題もありますが、理研の予算を使って特許申請維持できるのかということを確認するための実験をしているわけですから、Oct4-GFP人工遺遺伝子の設計が酸浴などという非常識な条件下に対してどうであるかということを研究するのが目的ではないわけですよね。そんなこと始めてたら検証は延々終わらないことになります。

[連投8]
では、理研に来る前に小保方さんが追及していた細胞は何であったのかというと、無論、ハーバードと東京女子医大時代に小保方さんはGFPなんて使っていません。qPCR検証です。丹羽さんはFigure3-aの実験で、酸浴スフィア塊から内在性Oct4遺伝子が発現しているとしたらとても微量だと気付いたので、今度はFigure3-bでコントロールをES10個分にしました。その結果が小保方さんが理研に来る前から追いかけていた細胞のようですよね。

[連投9]
丹羽さんの検証では一回の実験で50万個の肝細胞を使って最大ES細胞換算で12個分の発現量しかなかった。その12個分の発現量は12個に集まっているかどうかすら分からない。たくさんの数の細胞に微量に分散しているものの総体であるかもしれない。しかし、その一個にES細胞1個分の発現量のある酸浴細胞が1個でも存在していると大量に実験すると三胚葉に分化誘導できるシャーレが出現するかもしれない。50万個の細胞から丹羽さんはスフィア塊を20から30個作れている。小保方さんはその一回30万個の実験を何十回も行って何百個のスフィア塊を使って、ついに三胚葉分化を確認してるんでしょ。(手記53P)それが今あるティシュー論文でヴァカンティが今もなお特許申請継続している実験結果です。

[連投10]
物理刺激と酸浴刺激の違いはあるが、小保方細胞の出現経過は共通しているのではないでしょうかね。無論、こんな微量な細胞でキメラがネイチャー論文のようなあんなに高い確率でできてくるわけがありません。キメラは若山さんの曰くつきの"いたずら"です。ただ、その曰くはともかくとして、そんないたずらが可能であったのは丹羽さんが見つけたGFPの漏れ出し現象があったからです。原因は分からないが、これを何物かだと若山さんも思い込んだ。小保方さんも今までの細胞とは違って大量にできてきていると思いこんでいるんです。だから騙され続けた。二人とも共通にGFP蛍光のアーティファクトに騙されていたんです。

[連投11]
若山さんはよく光ってはいるけどこの細胞からキメラはできないと知っている。自分がキメラ実験してますからね。ただ、GFPの光っていることが内在性Oct4発現と対応していると信じ込んでいる。丹羽さんの検証実験はまだ行われていません。若山さんはこの細胞の核をクローン胚に入れてみたかったんですよ。それはいたずらなんかじゃない。正真正銘の科学者の好奇心ではないですか。そして実際にそれを行ってキメラと幹細胞を作ったが、その時に小保方さんを山梨大にリクルートしたいという別の事情と重なって、一時的な嘘をついたんです。その因果がここまで事件を引っ張ってきたのだとみています。

[連投12]
>>つまり、ＡＴＰ酸浴後肝細胞において、細胞は初期化遺伝子を働かせたということです。
>>ＴＳさんの解析でも明らかなように、ＳＴＡＰ細胞は、従来の遺伝子制御とは異なる細胞です。

その通りだと思います。いや、ハーヴァード時代からその意味では彼女の細胞は本物です。

①ハーヴァード以来の小保方細胞
②理研での酸浴細胞
③若山さんの曰くつき"いたずら"キメラと幹細胞

三つを分けて考えるべきだと思っているんです。

[連投13]
>>ExtFig4aの蛍光図は、肝細胞であることをしめす緑色蛍光です。・・・the cell aggregates were derived from 8-days old of Alb-cre/Rosa-GFP Tg mice.

ご指摘有難うございます。僕は以前からOct4-GFPだと勘違いしてました。3個目のスフィア塊にOct4蛋白染色がないのにGFPが光っているのを漏れ出し原因だと思ってました。ただExtFig4aはFig4aですね。

[連投14]
>>凝集塊は1０個位の細胞数にみえますけど、この位の数以下でないと胚には入らないような気がします。スフィア塊は、写真からみると大きいものから小さいものまで、かなり幅があります。

ティシュー論文に「Individual spheres possessed >2000 cells.(The Potential of Stem Cells in Adult Tissues Representative of the Three Germ Layers:Sept.2010)」とあります。STAP論文にもどこかにあったと思いますけど今見つけられません。いずれにせよ、勘違いなさっておられるので、図のブライトフィールドの三番目のスフィア塊の直径上に並んでいる細胞数を数えてみてください。12個程度でしょ。半径が6個のスフィアの体積は4πr^3/3で904個程度と逆残できます。写真はパラフィン固定して薄くスライスした中央付近の断面です。上は桑実胚なので16細胞期ですが、下は胚じゃなくてスフィア塊です。若山さんがナイフで切り分けてインジェクトするあれです。以上です。

連絡
>>学さん
場違いなところに前回の残りを投稿してすみませんが、ヤフーがおかしいようです。途中で投稿できなくなりました。以下のような表示です。(一部です。)
>
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1. 2019/06/01(土) 07:09:01|
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