どうやら以下はマウスのケースではなくヒトのケースのようですね。たまたま(Jβ2.4(62bp)***28bp***Jβ2.5(63bp))の間が短いからすぐ見つかるだろうと探したら無かったんですね。それと合計39bpないと変ですが28bpしかない。数え直したら35bpのようですが、いずれにしても足りない。従って以下はヒトの23RSSではないかと。
>>
HEPTAMER(7bp) 5' CACAGTG 3'
SPACER(12 or 23bp)
NONAMER(9bp) 5' ACAAAAACC 3'
アルイミオウジ変態糞ジジイに頑張ってもらいましょう。その間、我々は釣りです。ひひひ。なにしろ、遊んで暮らしているもんで。
********************************************************
ちょっとど素人の手に負えませんが、まず認識の間違いから訂正しておきましょう。以下はそもそもこんな問題になると思ってなかったので大雑把に調べた結果で、各J、Dエクソンは長めにとっている。アルイミオウジ変態糞ジジイの紹介してくれた表の見方がよく分からなかった所為です。以下は忘れましょう。
>>
Dβ2(17bp)-Jβ2.1(59bp)***571bp
Jβ2.1-Jβ2.2(60bp)***144bp
Jβ2.2-Jβ2.3(63bp)***201bp
Jβ2.3-Jβ2.4(62bp)***77bp
Jβ2.4-Jβ2.5(63bp)***28bp
Jβ2.5-Jβ2.6(56bp)***87bp
Jβ2.6-Jβ2.7(63bp)***154bp
では正しくはどうかというのは時間があったら調べて表にできますが、あの表ではグリーンに色付けされている部分をクリックすると分かるようになっていて、拡大すると赤のバーが出て、そこにこのエクソンのトリプレットコドンが区切り表示されていて、しかも対応する20種のアミノ酸の略号まで示されている。この部分が厳密なエクソン部分です。トリプレットですから必ず原則は3の倍数bpになる。(ならないのもある。)
我々ど素人の疑問は*ttp://crisp-bio.blog.jp/archives/8754896.htmlの報告とその中の動画に出ている12/23ルール(トウェルヴ・トゥエンティスリー・ルール)がヒトのTCRの話なのか、マウスにも共通する話なのかという問題で、まずそこの説明にある以下の配列がマウスでは簡単には見つからないということと、この計算だとイントロン領域は最低でも7+23+9=39bp以上の長さが必要だが、とても短い場所がある。Jβ2.4とJβ2.5の間が一番短そうだ。
>>
HEPTAMER(7bp) 5' CACAGTG 3'
SPACER(12 or 23bp)
NONAMER(9bp) 5' ACAAAAACC 3'
Jβ2.4とJβ2.5の間だけ調べた結果は以下です。8桁の数字は頭の核酸の位置です。
>>
Jβ2.4エクソン
41543362
AGT,CAA,AAC,ACC,TTG,TAC,TTT,GGT,GCG,GGC,ACC,CGA,CTA,TCG,GTG,CTA(3x16=48bp)
イントロン
41543411
GTAAGCTGGG
GTATAGTTTT
TGTGTTGGGT
TCTGGGGCTG
TG(42bp)
Jβ2.5エクソン
41543453
AAC,CAA,GAC,ACC,CAG,TAC,TTT,GGG,CCA,GGC,ACT,CGG,CTC,CTC,GTG,TTA(3x16=48bp)
この42bpのイントロンの中にマウスのRSSがあるはずなんですけどね。どうやらヒトの場合とは少し違うんでしょうね。イントロンの最後がTGTGになっていますが、これは各Jエクソンの上流直前の構造として共通だということは確認できました。また、更に19bpを隔てた先は必ずTだと分かっています。(J1.7のみはC、そもそもJ1.7があるんですね。)
********************************************************
かなり専門的でウィキレヴェルでは太刀打ちできなくなってきましたので、ここはアルイミオウジ変態糞ジジイに任せて、我々は本来の考察に戻りましょう。では登場人物さんたちお願いします。
- 2019/07/09(火) 09:55:29|
- STAP事件
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ヒトかマウスかの問題はひとまず置いておいて、12/23ルールというのはまずDエクソンの直後に
HEPTAMER(7bp)SPACER(12bp)NONAMER(9bp)=12RSS
のイントロンの並びがあって、Jエクソンの直前に
HEPTAMER(7bp)SPACER(23bp)NONAMER(9bp)=23RSS
のイントロンの並びがあるのね。この二つのRSS(recombination signal sequences)にRAG1/2(recombination activating gene 1 ,2)という酵素がそれぞれくっついて、その複合体が互いが近づき結合してヘアピン部分を作り、その部分で切り取って後にまた残りを修復して結合する仕組みなのね。
- 2019/07/12(金) 09:52:51 |
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- #-
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そうだね。スプライシングの仕組みに似ているけど、これはDNA二重鎖がほどけてその必要部分に沿ってmRNA前駆体が転写されるから、元の二重鎖はそのままなんだね。スプライシングはそのmRNA前駆体のイントロン部分を編集しちゃう。それに対して、TCR再構成は二重鎖をそのまま切り取っちゃうんだね。やり方自体はループを作って交差したところで切り取って繋ぐんでよく似てるけど、T 細胞受容体を作る遺伝子の一部が切り取られて再構成されたら元には戻れない。
- 2019/07/12(金) 09:54:21 |
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今いろいろと調べているけど、12/23ルールというのはヒトの場合のようだね。原理は同じだけどRSSの作られ方がヒトとマウスでは違うようだね。少なくとも以下の並びはマウスにはないね。
>>
HEPTAMER(7bp) 5' CACAGTG 3'
SPACER(12 or 23bp)
NONAMER(9bp) 5' ACAAAAACC 3'
- 2019/07/12(金) 09:55:06 |
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今調べのついている範囲で言うとマウスのDエクソンとその直後のイントロン40bpの並びは以下だ。イントロンの部分は数えやすいように便宜上5桁ずつカンマで区切っている。エクソンの3桁刻みは便宜ではなくてトリプレットだね。
D1
GGG,ACA,GGG,GGC
CACGG,TGATT,CAATT,CTATG,GGAAG,CCTTT,ACAAA,AACCA
D2
GGG,ACT,GGG,GGG,GC
CACAA,TGATT,CAACT,GGAAG,AGGTG,CTTTT,ACAAA,AAGCT
- 2019/07/12(金) 09:56:10 |
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あら共通した並びがあるわね。
D1-(CAC)GG,(TGATT,CAA)TT,CTATG,GGAA(G,C)C(TTT,ACAAA,AA)CCA
D2-(CAC)AA,(TGATT,CAA)CT,GGAAG,AGGT(G,C)T(TTT,ACAAA,AA)GCT
- 2019/07/12(金) 09:57:09 |
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マウスの場合でも仕組み自体は12/23ルールに似た形なんだろうけどね。
- 2019/07/12(金) 09:58:00 |
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下流側でJエクソンの上流30bpの並びは以下だ。
TTATT,T(T)TCT,CCTCA,TCCTA,TGGCA,C(TGTG)-J1.1
TCCAT,A(T)TCG,AGTAT,CTGTA,TTCTG,A(TGTG)-J1.2
GGGGT,T(T)TGA,AGTGG,ACCCG,GGAGG,C(TGTG)-J1.3
GAAGT,T(T)TAC,CACCA,GGCTT,TAATG,T(TGTG)-J1.4
GGGAG,T(T)TGT,CACCC,TCATG,TTGTA,C(TGTG)-J1.5
TAGGT,T(T)TAC,CAAGG,CCACC,TGCAG,C(TGTG)-J1.6
GGGGC,T(C)CAT,TTCTG,ACTGG,AGGGG,T(TGTG)-J1.7
AAGAA,T(T)CTT,GGTAG,CCCTT,TTCTG,C(TGTG)-J2.1
GAGGT,T(T)GTG,CCAGC,ATTTCCAGGA,C(TGTG)-J2.2
TGAGT,T(T)TTG,TCCTG,AGCCT,GGAGG,C(TGTG)-J2.3
CCAGT,T(T)TTG,TCCTG,TACCA,AGAGG,C(TGTG)-J2.4
ATAGT,T(T)TTG,TGTTG,GGTTC,TGGGG,C(TGTG)-J2.5
CGGGT,T(T)CTC,TTGGG,AGTCA,CAGGG,T(TGTG)-J2.6
CGGGT,T(T)GTG,TGTGG,GGTTG,AGCCT,C(TGTG)-J2.7
- 2019/07/12(金) 10:00:30 |
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ふむ。推測できるのは切り取りはDエクソンの直後からJエクソンの直前までのようね。つまりイントロン部分すべてね。
- 2019/07/12(金) 10:01:38 |
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一応そういうことにしとこう。その内アルイミオウジ変態糞ジジイが何かいい論文を探してきてくれるはずだ。
- 2019/07/12(金) 10:02:36 |
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いよいよ、PCRのバンドに並んできた断片の実際の長さが推測できそうになってきたね。
- 2019/07/12(金) 10:03:24 |
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J1.7エクソンもあるんだね。ただ、ここの前での切り取りがあるかどうかは分からないね。19bp隔てた場所が他のTと違ってCになってる。RSSとして認識されるのか否か全くわかってない。
- 2019/07/12(金) 10:04:15 |
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ややこしそうね。ただし、STAP論文はD2-J2.6だわね。その問題はよけて通れるんじゃないの。
- 2019/07/12(金) 10:04:58 |
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- #-
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ここでの我々の考察の本来の目的はGel2の2NキメラのTCR再構成バンドの意味するところだからね。
- 2019/07/12(金) 10:05:48 |
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小保方さんがESコンタミさせて若山さんにキメラを作らせていたのなら、このキメラ体細胞からは原理的にGLライン以外は出ないね。これはわかり切ってる。
- 2019/07/12(金) 10:06:25 |
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- #-
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小保方さんがESコンタミ犯なら、このGel2のPCR結果は何か別のものを検体にしているということにならざるを得ないね。小保方さんが犯人なら、小保方さんは酸浴細胞以外はTCR再構成がないからGLバンドしか出ないと知ってるし、必ずGLバンドが出るということも分かっているね。
- 2019/07/12(金) 10:07:27 |
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2Nキメラを使わせたのは若山さんよね。だってESで騙されたか否かは別としてキメラは若山さんにしか作れない。この実験は三誌投稿時最初のネイチャーでリジェクトされて、次のセル誌には書いているんだから5、6月に行われている実験ね。
- 2019/07/12(金) 10:08:13 |
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常識的に考えてキメラマウスの体細胞にTCR再構成があるか否かを調べるときに2Nキメラを使わせるということ自体がすでにど素人の我々にすら疑義を抱かせるものだよな。
- 2019/07/12(金) 10:10:13 |
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4月にTCR再構成のアドヴァイスを受けた時に小保方さんはどんなSTAP由来キメラを持ってたのかしらね。2Nキメラと4Nキメラとどちらも出産させて飼育維持していたものがあったのかしら?
- 2019/07/12(金) 10:11:01 |
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馬鹿な事言っちゃいけないよ。小保方さんは客員でマウスの飼育維持の仕事はできないよ。2012年に入ってから二度目の確認実験をしたときにいろんなSTAP細胞由来キメラマウスを作っていて、それはあったはずだ。ただ、できたキメラマウスを生かして5,6月まで維持していたかどうかは分からないね。何しろ桂調査チームは調べた結果を何も公表していないんだよな。この時の実験は小保方さんの実験ノートがあるとされている。使われた2Nマウスがいつ作られたものかは聞き取り調査と若山さんの実験ノートとの照合ですぐにわかるはずなんだけどな。キメラのTCRに関しては触れもしていない。
- 2019/07/12(金) 10:12:47 |
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新たに作ろうとしたら最短でも1か月近くかかるわね。それと新たに作るなら4Nを作るに決まってるわね。どうしてわざわざリシピエント胚由来の体細胞が混ざる可能性を排除しないのか意味が分からない。
- 2019/07/12(金) 10:16:53 |
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ということは、この時とりあえず維持されていたマウスが2Nキメラしかなかったということかもしれないね。
- 2019/07/12(金) 10:17:39 |
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とてつもなく怪しい実験だよな。若山さんは本気でやってないよな。2Nでやっちゃいけないでしょ。なかったら新たに4Nキメラを造ればいいだけだ。小保方さんに何をやらせているんだよ。西川さんのところには一緒にアドヴァイスを聞きに行ったんでしょ。小保方さんが2Nキメラを調べたのは知ってるよな。セル誌を見ているでしょ。
- 2019/07/12(金) 10:20:14 |
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それどころか特許申請手続き用として理研の知財に2NキメラのTCR結果を提出している。ここにはACCsという記載があって、若山研時代のデータだと分かっている。提出者は小保方さんではないよ。ラボのボスは若山さんだ。
- 2019/07/12(金) 10:21:06 |
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なぜ、西川さんのアドヴィスの後に若山さんは4Nキメラを小保方さんに作ってやらなかったんだろうか。
- 2019/07/13(土) 07:07:48 |
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- #-
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西川さんは3/17にアドヴァイスしたと証言しているが、手記で小保方さんはネイチャーリジェクト後に相談に行ったと言ってる。
- 2019/07/13(土) 07:08:44 |
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- #-
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若山さんとの話の過程で出ているんだよな。若山さんが小保方さんに話してないだけだね。リジェクト後にもう一度相談に行ったときに小保方さんは初めて知ったということでしょ。手記の書き方では西川さんは小保方さんの論文の原稿は既に読んでるんだよな。若山さんは論文を通したくないし、そもそもTCR確認したら自分が何をしたかばれてしまう。
- 2019/07/13(土) 07:10:23 |
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- #-
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もし小保方さんが冷凍でも4Nキメラを持っていたとしたら、どうして彼女は4Nキメラを使わなかったのかしら。
- 2019/07/13(土) 07:11:01 |
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- #-
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もし、小保方さんが冷凍で4Nキメラを持っているにも関わらず、2Nキメラを使って実験したのだったとしたら、若山さんはどうして注意しなかったのかな。だってセル誌には出したんでしょ。それに別の実験とは言え理研の知財にデータ提出している。
- 2019/07/13(土) 07:11:54 |
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西川さんはどうして、小保方さんの2Nキメラの実験を変だと注意してやんなかったんだろう。吉村さんですら変だと言ってるのに。
- 2019/07/13(土) 07:13:01 |
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- #-
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2Nキメラの体細胞を使ってTCR再構成を見るって、どういう意味になるのかな。
- 2019/07/13(土) 07:14:26 |
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- #-
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仮にそれがマウスの尻尾だったとしよう。そのキメラ尻尾部分がSTAP由来細胞の分化してきたものだという保証はないから、TCR再構成確認以前に例えばCAGマウスを使っているSTAP細胞をドナー細胞として使っているのなら、尾部細胞をGFPでFACS選別してから、GFPのある細胞だけをPCRに掛けることになるね。尻尾がリシピエント細胞の分化してきたものだったらTCR再構成なんてあるわけがない。
- 2019/07/13(土) 07:15:12 |
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- #-
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GFPが入っていたら由来は証明されていることになるんだけど、加えてESではないという証明にTCR再構成を使うわけだね。4Nキメラを使えば胎児はすべてドナー細胞由来になる。2Nでやるなんてこと自体がそもそも馬鹿げている。
- 2019/07/13(土) 07:16:13 |
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- #-
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何やってるの。こいつら。
- 2019/07/13(土) 07:17:00 |
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笹井さんたちはこの時参加してない。竹市さんもまだ参加してない。この話は、ヴァカンティさん、小保方さん、若山さん、西川さんの間で行われている話に過ぎない。この時捏造問題なんて発生していないからね。勘違いしないようにしてもらいたいね。論文はまだまるで通っていない。
- 2019/07/13(土) 07:17:39 |
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我々のntES論だと若山さんは論文が通ってもらっては困るんだよな。ネイチャー誌にリジェクトされた後、ヴァカンティは小保方さんに対して低いバーを飛ぶつもりかと自分の主催しているティシュー誌に小保方さんの論文を掲載することを拒んだね。若山さんが小保方さんを連れて、西川さんに相談したのはその後の話さ。
- 2019/07/13(土) 07:18:41 |
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なるほどな。
- 2019/07/13(土) 07:19:31 |
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若山さんはどうして小保方さんを連れて西川氏のところに行ったのだろうか。
- 2019/07/13(土) 07:22:59 |
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西川さんこそどうしてTCR再構成のアドヴァイスをしたの?
- 2019/07/13(土) 07:23:56 |
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小保方さんの論文がネイチャーにリジェクトされたからヴァカンティのティシュー誌に掲載しておくのかなと思ったら、ヴァカンティが小保方さんに対して低いバーを飛びたいのかと励ました。
- 2019/07/13(土) 07:24:52 |
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小保方さんはヴァカンティがそう言ってますからと伝えたろうな。
- 2019/07/13(土) 07:25:34 |
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論文がどこかに掲載されない限りは若山さんは小保方さんを山梨大の助手として連れて行くことができないね。ヴァカンティはキメラがスタンダードなプロトコルに従ってできたと信じている。無論、小保方さんもだ。
- 2019/07/13(土) 07:34:12 |
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若山さんは小保方酸浴細胞の核使用ntESからキメラと幹細胞を作っているだけだ。これからその性質を調べようと思っている時に小保方さんがアメリカに帰りそうになったから、山梨大の助手として勧誘できるようになる翌年の年度末まで引き留めようとして、キメラができたよと嘘をついていただけだったね。若山さんは無論酸浴によるGFP蛍光を何事かだと信じ込んでいる。この時にはこのntES化実験の成果を期待していたはずだね。
- 2019/07/13(土) 07:36:21 |
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翌年に若山さんは予定通りに小保方さんを再び自分のラボに来いと誘った。山梨大で助手として雇用すると勧誘したんだね。無論、論文が出るまでは自分のところに所属していてくれとヴァカンティに言われているんだから、小保方さんはその時点では、自分の意志を示せない。そこから小保方さんに論文を書かせることと、小保方核使用ntESの二股をかけた実験が続くことになるんだな。
- 2019/07/13(土) 07:36:59 |
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- #-
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その時に本当のことをなぜ言わなかったのかな。
- 2019/07/13(土) 07:37:36 |
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- #-
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一つには若山さんは小保方さんが自分に懐いていて必ず来てくれると信じていたのと、山梨大の助手というポストはポスドク2年目の小保方さんにとってとてもいい話だと思っていたから、その意味でも二つ返事だと思っていたんじゃないかな。でも小島の話をピーチ姫が書き留めているように、ヴァカンティは小保方さんに対して7年後のハーヴァード大の教授職への推薦も口にしていたんだよな。小保方さん自身の心も定まってないところに、そもそも現在ハーヴァード所属の身として日本出張している立場で、二つ返事できないのは当たり前だ。若山さんも何か舞い上がってたんじゃないかな。
- 2019/07/13(土) 07:38:56 |
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舞い上がっている原因は酸浴GFP蛍光している細胞をntES化してみるという自分にしかできない細胞を研究対象として山梨大で大きな研究予算を獲得するという夢が若山さんの心を占めているんでしょ。でもそのためには小保方さんと酸浴細胞をヴァカンティの許から奪わないといけない。
- 2019/07/13(土) 07:39:50 |
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- #-
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ntES化した結果がどういうことになるのかまだ若山さん自身も分かっていない段階なんだね。これから急いで方向性を出そうとしていて、小保方さんが来てくれるとはっきりしたら本当のことを言おうと思っていたんだけど、返事を保留されたから、仮に来ないということになったときにはこの酸浴細胞のntES化というアイディアがアメリカにわたってしまうことになるんだな。アイディアを知られるとntES化というのは若山さんでなくてもできる。
- 2019/07/13(土) 07:41:41 |
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- #-
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ヴァカンティとしては小保方さんの研究は自分の胞子様細胞から出発しているから若山さんに渡すつもりはないのよね。小保方さんから山梨大の助手で誘われていると聞いているだろうから、急いで米国特許の仮申請までしたのね。でも、若山さんは赤ちゃんマウスを使うというアイディアを出したり、自分のところのGOFマウスを使わせて発見された経緯から、ヴァカンティ研に酸浴細胞の貢献度はそれほどないと思っているのよね。まして、ntES化させるという技術は自分のものなのよね。これが対立の原因になっていったわね。
- 2019/07/13(土) 07:42:44 |
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- #-
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若山さんにとってもまだ先の見えてない試行錯誤過程にあって、小保方さんの意思表示も無い状態で、引き留めのための最初の罪もない嘘は継続されて行ってしまったんだな。
- 2019/07/13(土) 07:43:34 |
- URL |
- #-
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若山さんはとりあえず小保方さんに論文を書かせるという仕事と、ntES化された細胞にどんな違いが出るのかの研究という二つの仕事を同時並行で行うことになったのね。後者の仕事は胎盤が光るという話に発展して行って、前者の仕事は最初のネイチャー投稿で、リジェクトされたから、後はヴァカンティが自分の主催のティシュー誌に論文をぶら下げたら終わりじゃないか。小保方さんはヴァカンティへの約束を果たして晴れて自由の身で山梨大に来ることができると思ってたんでしょ。
- 2019/07/13(土) 07:46:23 |
- URL |
- #-
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ところがヴァカンティは高いバーを飛びなさいと小保方さんを励ました。キメラは普通にできていると信じ込んでいる彼にとっては当然のアドヴァイスだよな。キメラができたというのは酸浴細胞が本物の多能性細胞であるという最終証明なんだからね。彼は若山さんが酸浴細胞からはキメラは出来ないと分かったのちに、それをntES化してみるという実験を始めたなんて思ってもいないからね。
- 2019/07/13(土) 07:47:14 |
- URL |
- #-
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でも、若山さんは、小保方さんに対して、キメラは出来なかったということを最初に示したわよね。
- 2019/07/13(土) 07:48:17 |
- URL |
- #-
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小保方さんは思い込みの強い人みたいだね。それはスフィア塊からテラトーマができなかったとき、ヴァカンティ足場を使ってまでテラトーマライクを作っているところに現れている。科学者は現象の事実に従わないといけないよね。事実を解釈で捻じ曲げてはいけない。僕が小保方さんの教育者だったとしたら、その執念深さは新発見をするための才能であると同時に、自然が教えてる事実から目をそらす欠点があるとも思うかもしれないね。
- 2019/07/13(土) 07:49:27 |
- URL |
- #-
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その見方は、若山さんがまず最初に明確にできないということを示したという事実を重んじるんだね。次に自分の計画であったntES化の実験を始めるに際して、そのことを何も言わずにただナイフ切り分けでできたよと説明したときに、小保方さんになぜできたかということに気づいて欲しいという教育的目的があったのではないかという疑義だね。なにしろこの頃に若山さんは小保方さんに対して悪い感情を持ってる筈が無いからね。
- 2019/07/13(土) 07:51:04 |
- URL |
- #-
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いろいろと兼ねてるんじゃないかということだね。いろんなことを同時にやろうとするとややこしくなるよね。何もかも裏目に出てしまうというようなことにもなり得るね。
- 2019/07/13(土) 07:52:08 |
- URL |
- #-
- [ 編集 ]
今我々は光る胎盤を追っている過程で、2NキメラのTCR問題で躓いているんだよな。
- 2019/07/13(土) 07:53:01 |
- URL |
- #-
- [ 編集 ]
この問題の本質はなぜ2Nキメラで4Nキメラで無いのかということだね。何をおいてもまずそのことが解明されないといけない。2NキメラのTCR再構成確認なんてそもそも意味がない。なんでこんな実験が行われているのかというとこだな。
- 2019/07/13(土) 07:54:23 |
- URL |
- #-
- [ 編集 ]
直接の原因は最初の論文がネイチャーにリジェクトされたからだわね。
- 2019/07/13(土) 07:55:09 |
- URL |
- #-
- [ 編集 ]
加えて、ティシュー誌にぶら下げて置けば終わりのはずが、終わらなかった。
- 2019/07/13(土) 07:56:00 |
- URL |
- #-
- [ 編集 ]
小保方さんは何とかしないといけなくなったのね。それで若山さんと一緒に西川さんのところに相談に行ったら、TCRだとアドヴァイズされた。
- 2019/07/13(土) 07:56:42 |
- URL |
- #-
- [ 編集 ]
細胞のトレースのためにTCR再構成を確認するということだね。リジェクト理由になってるからだね。
- 2019/07/13(土) 08:00:49 |
- URL |
- #-
- [ 編集 ]
キメラの由来細胞のトレースが最終目的なんだからだれだって4Nキメラでやるね。
- 2019/07/13(土) 08:01:43 |
- URL |
- #-
- [ 編集 ]
若山さんは小保方さんに4Nでやらないといけないよとすら指導してないのね。それに幹細胞の検証をしたのは小保方さんでなくラボの仲間ね。
- 2019/07/13(土) 08:04:12 |
- URL |
- #-
- [ 編集 ]
そこをまず押さえて後に、でも2Nの結果は出ているが、それはどういうことを意味するのかという問題に入るんだね。
- 2019/07/13(土) 08:04:55 |
- URL |
- #-
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- 2019/07/13(土) 08:10:03 |
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