一言居士の独言

[組織由来別STAP細胞キメラ1]
>>学さん
>学とみ子的には、組織由来別のSTAP出てきた時点で、その度に核移植細胞を作ってたら大変じゃあないのかな？

学さんには必要ないとは思いますがntESの作成手順は以下ですね。作るのはお手の物ですよ。STAP実験とは別に自分たちが毎日やってる実験です。
①リシピエント卵を徐核し、ドナー核をインジェクトしてクローン胚を作る。
②クローン胚を仮親の子宮に入れて発生させる。このクローンマウスの達成率は数%と言われている。
③達成率向上手段として、このクローン胚を胚盤胞期まで培養して正常に成長したもののいくつかのインナーセルマスを取り出してES培養する。この時のntESの樹立率は20%程度だと言われている。
④このntESの4Nキメラを作って近似クローンとし、生殖細胞を採取して畜産応用技術とする。

[組織由来別STAP細胞キメラ2]
全ての準備がされている段階からのスタートだと、胚盤胞期というのはE4ですから、ntES作成にかかる日数は4日です。培養確認も行えば、1週間は普通のキメラ出産まで余計にかかる。私が[応答5-追伸]に<他の実験で作られたキメラである可能性もある。>と書いているのはそのためです。もっとも生まれてから相当日数経過してから渡せば小保方さんは気づけませんけどね。私の仮説では小保方さんに論文を書かせるまでは若山さんは小保方さんをヴァカンティの手から奪えないので、論文を書かせるために渡している試料です。できるだけリジェクトされるように書いてもらわないといけませんからね。

[組織由来別STAP細胞キメラ3]
再掲
[応答5-追伸]
行われていたのなら、どうやってそんな論旨に不都合なキメラ率の悪いキメラを渡したのでしょうかね。ntESにしたら達成率の悪さは別にして普通にキメラはできます。肝臓由来STAPキメラがたまたま肝臓にのみしか行ってないほどのキメラ率の低いキメラや、皮膚由来STAPキメラが皮膚に多くキメラ形成しているようなキメラを渡すというのはおかしな話で、Article Figure 4-dのようになんにでも分散してキメラが入っているサンプルを選択できなかったというのも変ですね。他の実験で作られたキメラである可能性もある。若山さんは論文が通ってもらっては困るんですね。特許も同じです。通ってもらっては困る。若山さんの真の目的はただ小保方さんをヴァカンティに縛り付けている条件である"論文を書"かせて、彼女をヴァカンティの許から解放して、山梨大に連れていくことだけだったんです。

[組織由来別STAP細胞キメラ4]
<引っ越し配慮で、お願いします>とおっしゃるわりに質問があるのでその意味を図りかねますが、僕はこのSTAP細胞核移植ntESを作る具体的な作業過程でTSR再構成された細胞にぶち当たる確率に関してご教示願っておきたいんですが。以上です。


[どのように考えるか1]
>>学さん
>私がTCRを話題にしていても、STAP派の方からコメントがないのですが、どのように考えますか？

私の場合は異論がないからです。ただし私は小保方細胞核使用ntES由来キメラとして考えて、という意味です。

[どのように考えるか2]
>そこにあるキメラ尻尾のTCRは、なぜ、皆さん騒がないのでしょうか？ES派は、なんらかの秘密を共有していて気づかないふりをしているのではないか？（ホントに知らない可能性もありますが・・・）

私はエクセル原稿を貼りつけて連続送信するものですからスパム認識されて書き込み禁止になってしまうようです。一旦そうなってしまうとそこにはもう入れません。この場所で論じるのが適当でない場合は議論用の2を作っていただけるとそこでお答えします。しばらく待ちます。以上です。

[TCRの件1]
>>学さん
>そこにあるキメラ尻尾のTCRは、なぜ、皆さん騒がないのでしょうか？

過去に一度議論されているまま、分からないことが多すぎて中途半端に放置されれているからです。あたなも僕がntESであったとしたらこの結果をどう解釈てきますかと問うているのにまだ答えて下さっていない。ここで問題提起しましょう。

[TCRの件2]
まずアーティクル論文はご承知の通り、以下です。
>>
(本文)
In addition, genomic rearrangements of Tcrb (T-cell receptor gene) were observed in Oct4-GFP+ cells derived from FACS-purified CD45+ cells and CD90+CD45+ T cells (Fig. 1i, lanes 4, 5, and Extended Data Fig. 2e–g), indicating at least some contribution from lineage-committed T cells.

[TCRの件3]
(Fig. 1i)
i, Genomic PCR analysis of (D)J recombination at the Tcrb gene. GL is the size of the non-rearranged germline type, whereas the smaller ladders correspond to the alternative rearrangements of J exons. Negative controls, lanes 1, 2; positive controls, lane 3; FACS-sorted Oct4-GFP+ cells (two independent preparations on day 7), lanes 4, 5.

[TCRの件4]
(Extended Data Fig. 2e–g)
e, Schematic of Tcrb gene rearrangement. f, T-cell-derived STAP cells. Scale bar, 100 μm.

[TCRの件5]
g, Genomic PCR analysis of (D)J recombination at the Tcrb gene of T-cell-derived STAP cells. G.L. is the size of the non-rearranged germline type, whereas the smaller ladders correspond to the alternative rearrangements of J exons (confirmed by sequencing). Negative controls (ES cells), positive controls (lymphocytes) and T-cell-derived STAP (two independent preparations on d7) are indicated.

[TCRの件6]
(マテメソ)
TCR-β chain gene rearrangement analysis
Genomic DNA was extracted from STAP cells and tail tips from chimaeric mice generated with STAP cells derived from CD45+ cells. PCR was performed with 50 ng DNA using the following primers (Dβ2: 5′-GCACCTGTGGGGAAGAAACT-3′ and Jβ2.6: 5′-TGAGAGCTGTCTCCTACTATCGATT-3′) that amplify the regions of the (D)J recombination.

[TCRの件7]
The PCR products were subjected to gel electrophoresis in Tris-acetate-EDTA buffer with 1.6% agarose and visualized by staining with ethidium bromide. PCR bands from STAP cells were subjected to sequencing analysis and identified as rearranged genomic fragments of the (D)J recombination.

[TCRの件8]
(マテメソ)には二種の細胞で確認されたと書かれている。
①STAP cells
② tail tips from chimaeric mice generated with STAP cells derived from CD45+ cells.

①はどういう細胞かというと(本文)に書かれているようにを酸浴させてになって蛍光している細胞ですね。再構成を受けている細胞がたまたま全部死滅しない限りは<①STAP cells>のPCR検査結果は陽性になるに決まっていますね。そもそも確率的にある程度高く残るのでなければ西川さんのアドヴァイス自体が細胞追跡法としてそんなに良い方法ではないわけです。西川さんはとてもたくさん光ってるから再構成細胞もたくさん入っていると大まかに考えている。

[TCRの件9]
そしてこの(Fig. 1i)のレーン表示に白線を入れるというお作法上の問題があって石井調査チームによって不正とされた。これは定量ではなくてあるかないかの定性検査なのだからそんなお作法は無いという認識だったというのが小保方さんの弁明ですね。これはサイエンスの査読でも注意されていただろうとも騒がれましたが、意識してなかったと言ってますね。石井さん自身が昔同じことしていて、当時は問題なかったようですね。でも委員を辞任しましたね。科学的事実認識としてはどうでもいい話ですね。再構成はあったということで、確率的にもその程度入っていておかしくないですよね。

[TCRの件10]
(Extended Data Fig. 2g)の方はどうかというとTcell STAP #1にはあるが、#2にはバンドが何もない。つまりベータ鎖部分のDNAが分解されてしまっている細胞群ということになりますね。どんな細胞であれ、再構成されていないときにはGLに溜ってこないといけないですね。再構成されて短くなった奴の長さの順番にラダーができる。一番短い奴が最下段にまでひっぱられる。検体は(本文)によれば(FACS-purified CD90+CD45+ T cells)ですよね。でも検体は同時に(Oct4-GFP+ cells )です。このGFPのFACS選別の際に何を基準にしたのかわかりませんね。遺伝子なのか蛋白質なのか。遺伝子であったらDNAは全部分解されているわけではない。するとベータ鎖部分だけが分解してしまったということになる。もし残存蛋白質なら死細胞自体のDNAが全部分解されてしまっている集団だったのかもしれない。なぜラダーが何にもないのかの説明は書かれていませんから読み手には分かりませんね。理解はそこで止まります。

[TCRの件11]
総じてこの実験で明らかになったのは体細胞であるCD45陽性リンパ球を酸浴させてOct4-GFPを発現している細胞の中にTCR再構成を受けている細胞が含まれていることがあるということです。酸浴させた段階でも生き残ることがあるよという証明だけです。
問題は<② tail tips from chimaeric mice generated with STAP cells derived from CD45+ cells.>ですよね。STAP細胞を移植したキメラなんですからここからTCR再構成を受けている細胞が出てきたら、それはSTAP細胞がキメラ形成能を持った証拠なのだという西川さんの細胞追跡法を実践したものです。キメラの尻尾の細胞は血液ではありませんから、ここに再構成があったら、それはSTAP細胞の中に含まれていた再構成細胞が分化してきたものだということになります。再構成を受けているT細胞の割合はどういうことになっているか。以下です。

[TCRの件12]
CD45というのは白血球共通抗原のことですね。マクロファージは単球からの派性細胞ですね。
Balb/C系統♂10週齢マウス白血球構成
リンパ球 70%、単球3%、好酸球2%、桿状核好中球17%、分葉核好中球8%
Balb/C系統♀10週齢マウス白血球構成
リンパ球 82%、単球2%、好酸球4%、桿状核好中球8%、分葉核好中球4%
Balb/C系統♂♀Ave.10週齢マウス白血球構成
リンパ球 76%、単球2%、好酸球3%、桿状核好中球13%、分葉核好中球6%

[TCRの件13]
白血球の中に占めるリンパ球は成体マウスの全身で雌雄平均76%というデータですね。実験は赤ちゃんマウスで、かつ、脾臓からの取得なのでその構成比は違いますが参考にはなりますね。その中の更なる詳細構成はど素人なのでうまく検索できないんですが、マウスの場合でひとつのデータとして仮りに、B細胞:60%、T細胞:30%、NK細胞10%としておきましょうか。
CD45で選別するとT細胞は全体の23%で、かつ脾臓に来た段階でTCR再構成を受けているT細胞の割合はまた少なくなる。仮に半分としても11%です。でも楽にPCRにかかってきますね。CD45+選別だけのSTAP細胞は必ずバンドが出る。それが(Fig. 1i)ですね。

[TCRの件14]タイトル連番抜けたので再送です
対して(本文)の(CD90+CD45+ T cells)という書き方だと先にCD90でT細胞を選別して置いて、そこからCD45で白血球以外でCD90を発現しているかもしれない細胞を取り除いているんでしょうね。ほぼT細胞だけですね。CD45+ 選別よりもっと確率は高くて少なくとも半分はラダーが出る。出ない集団でもGLはでますから#2が如何に少ないケースに当たったかということは特筆すべきでしょうね。私は小保方さんが多忙の疲れた頭で何か勘違いして、あえて無いものも示すべきというような思い込みで、GLすらない特殊なケースを入れてしまったのではないかと思います。

[TCRの件15]
ではキメラはどうなのか。まず前提としてこのキメラは当然4Nキメラですよね。2Nだとリシピエント胚由来の尻尾の部分の細胞に当たる可能性がある。当然4Nキメラです。この実験は行われたと(マテメソ)にありますね。でもキメラの結果に関しては何も触れられていない。これは編集中にキメラ結果記述が削除されたからですね。笹井さんと丹羽さんが外させているんですね。その理由があるんですね。

[TCRの件16]
問題はこの時に使われた細胞は何かということです。できるだけ実験がより厳密になるように(CD90+CD45+ T cells)だったとしてみましょう。そもそもSTAP細胞作製時点でTcellが大半であれば残ってくる細胞も、幾分かは別の細胞があるにせよ、Tcellですね。このTcellの中は再構成されているものとされていないものがあるんですね。でもキメラ胚に移植されるのは1個ではなくて20から30個程度ですね。再構成のあるT細胞と無いT細胞のなにがしかの割合での混合物が移植される。

[TCRの件17]
(FACS-purified CD90+CD45+ T cells)を酸浴させ(Oct4-GFP+ cells)となったものをキメラ移植するときの細胞構成要素
①再構成されたT細胞
②再構成されていないT細胞
③FACS選別でわずかに混じり込んでくるB細胞等のリンパ球もしくはリンパ球以外の白血球等

[TCRの件18]
上記①～③はOct4-GFP標識基準でSTAPとされているものですね。この標識の当否に関するサイエンス査読者の指摘もあったが、後に丹羽さんがGFPの漏れ出し現象を指摘したことで根本的な瑕疵の存在があきらかになった。しかし、この時点では知られていませんから、当事者たちはSTAP細胞だと信じている。そこは問題ないですね。でもこの時点でも問題はこのキメラはGOFマウスの酸浴4Nキメラなんでしょうねということです。F1だと(Oct4-GFP+ cells)を確認せずに、スフィア形成しているというだけの形態判断で、選別されたことになっている。この場合は本来ならOct4-GFPを発現してないから取り除かれるスフィア塊まで入ってくる。つまり単なる体細胞の生き残りまで入っているということになる。(後の丹羽さんの検証を踏まえてGFP標識は当てにならないという前提で考えるとほとんどすべての細胞塊は体細胞のままだということになりますけどね。無論今は実験は本物であったという前提で考えています。)

[TCRの件19]
さて、論文ではキメラ実験はしているのにその結果がどこにもない記述の仕方になっているので、幹細胞側のTCR結果推移経緯も知っていた丹羽さんが後々に問題になりそうな結果は外させたから、本文のこの部分に関する記述が尻切れトンボの様相になったのだと推測されるところだと述べました。
僕はあちらと学さんとの間の議論の経緯はフォローしてませんので、そこは前提されてください。問題になっているのは特許図にキメラ尾部のTCR再構成結果らしきものがあるということですよね。ここは以前から議論のあるところでしたよね。

[TCRの件20]
アーティクルの(マテメソ)で行われた実験は当然4Nでなければ厳密な証明にはなりませんね。ところが特許図は2Nキメラなんですよね。もし、最初に添付されていたはずの<② tail tips from chimaeric mice generated with STAP cells derived from CD45+ cells>が特許図に類するものであったのなら、幹細胞側の経緯もあいまって、丹羽さんがそれを取り合えず外させるのは当たり前ですよね。若山さんが引っ越しの多忙が落ち着いたら4Nでやってもらえばいいだけです。でも、そういう事情の詳しい事実関係は分からないのでネットでの議論が中途半端のまま終わっていたんではなかったですか。

[TCRの件21]
2NキメラであってもTCR再構成があればリシピエント側のインナーセルマス由来でないのは明確ですから、西川さんの意図した証明にはなっているんですね。ただし、特許図は9例すべてに再構成があるんですね。従ってこれは2Nキメラのリシピエントとドナー細胞のどちらが来るかという確率を考えても再構成のある分だけの9例だということになる。仮に尻尾なら、リシピエント側の細胞が尻尾にならなかったキメラが無いということは確率的にありませんからね。9例もあれば半々になる。従って18例程度あっての半分の9例ということになる。

[TCRの件22]
再構成のある2Nキメラマウスの尻尾はそれぞれ独立したマウスの尻尾だということですね。そこで以下の御質問になる。大事なところなので、TCR再構成実験のど素人理解開示の途中ですがその問題もからめて検討しましょう。

>あなたの核移植では、一つの細胞を選びますから、それがT細胞なら一種類のTCRが増幅されます。そこ、大丈夫ですか？

大丈夫ではないかもしれませんね。でもその時は僕は自分のntES仮説を間違いだと知って捨て去るだけですよ。大した問題ではありません。僕の探求の目的はSTAP事件の真実理解です。ただし、僕はntES仮説を捨て去ると僕にとってはまだよくわからない共培養仮説程度しか他に乗り換えるべき道を今のところ持ってないんです。ほとんどの可能性ある道は虱潰しに歩きつぶしている。どこかに別の道がありますかねえ。それを知りたくて学さんのブログにきているのです。

[TCRの件23]
私の説は小保方細胞核をntESにしてみたということですからね。その手順は上述した以下の細胞のどれかを一つ選ぶということですね。無論達成率が低いのでたくさんのクローン胚を作る。でもそこに入れられたそれぞれのクローン胚のドナー核はおっしゃる通り一つです。
①再構成されたT細胞
②再構成されていないT細胞
③FACS選別でわずかに混じり込んでくるB細胞等のリンパ球もしくはリンパ球以外の白血球等

[TCRの件23]
まず当たった細胞が①だったとするとこのキメラの体細胞はPCRで調べるとTCR再構成されたラダーのどこか一つしかないゲル写真になります。②の場合はGLラインだけの出るゲル写真になる。③の場合も同じですね。GLだけだ。
ところが、特許図20にはラダーのあるゲル写真が９例あるから、ラダーがあるということは多種の再構成細胞があることを意味しているのだからこれはntES由来ではないということになるというお答えですね。有難うございます。お返事は今頂きました。

[TCRの件24]
では、翻ってその特許図の方の検討に入りましょう。
日本文の特許図20には<2Nキメラマウス由来SAC>とあって意味が分かりにくいですが、元の英文は<2N CHIMERIC MICE DERIVED FROM SACs>で、SACsはStress Altered somatic Cellsの略ですね。ただし、尻尾の細胞で調べたか否かは特許条文には書かれていない。この小保方細胞の名前がSTAPになったのは笹井さんの参加して以降で、それ以前の3誌論文ではSACsでした。

[TCRの件25]
最初にネイチャー投稿した論文を根拠にヴァカンティが2012/4/24に米国特許仮出願したものと、後に理研若山研時代に若山さんが理研の知財と検討していて、ヴァカンティと対立していたころの幹細胞化関連特許原案の作成過程までの経緯を新たなSTAP論文につなげて、理研、ハーヴァード、東京女子医大の三者共同申請に纏めたものがこの特許申請書ですが、TCRのアドヴァイスはネイチャー論文がリジェクトされて西川さんに相談したという小保方さんの手記記載が正しいならは５月前後の実験ですね。セルに載せたのが最初と調査報告されている。

[TCRの件26]
この２Nキメラの尻尾かどうかは確定できないが何らかの特定された部位の体細胞をある程度の量を取ってPCRにかけたらベータ鎖DNA部位が短くなるなり方に違いのある多様な細胞があると分かった。つまりこの体細胞部位には再構成のされ方の異なっている細胞がたくさん含まれているということです。こういうことはどういうケースで起きるか。特定部位は仮に尻尾だとしておきましょう。移植細胞数は２０個程度だとしましょう。
①多様なTCR再構成を持つSTAP細胞を２０個程度移植してその細胞がほぼ全部均等に尻尾に入った。だからラダーが２０程度出ている。
②１、2個のTCR再構成を受けたSTAP細胞だけが尾部に入ったがPCRの元サンプルに血液が混じっているから、再構成されていないT細胞から作られたキメラのリンパ球が新たに各種のTCR再構成を起こしてラダーが出来る。

[TCRの件27]
STAP細胞もSTAP核使用ntESも一つずつは起こしていたとしても一種類の再構成しか起こしていませんね。②のケースは私のntES仮説のケースも含まれますね。
では①はどのくらい起こりにくいでしょうね。キメラ胚に入れた時リシピエント側もドナー側も２０個程度ずつで４０個のインナーセルマスになっている。ここからまず三胚様分化し、各器官に分化発生していくわけですが、ドナーとして20個入れた細胞が増殖してそれぞれの一部が尻尾に20種類ほぼ均等に分配されていくというのはとても考えにくいですよね。でもラダーは9例とも20くらいあるじゃないですか。変ですね。血液が混じってしまっているんだと思っています。だから丹羽さんがこの図を外させた。すでに出ている見方です。

[TCRの件28]
私のntES仮説は取り合えずSTAP事件で知られている諸情報を無矛盾に包摂できている唯一の仮説として考えたものです。ミッシングリングの存在があって、他に同時並行的に成立する仮説もある可能性は否定できませんが、私には思いつけないだけです。また他の仮説はどれも完全論証されていませんね。これは論証なので本当はキメラがntESで作られていると直接実証できる道があれば一番いいのですが、今までのところでは和モガさんの見つけてきた金華豚の論文でmtDNAのヘテロプラズミーを調べる方法をTs.Markerさんとされていましたが、うまく見つかりません。

[TCRの件29]
今学さんから貴重な御批判を頂いたのが契機で私はもう一つ、一個のＴ細胞由来ntESが元となっているはずのキメラの体細胞のTCR再構成の再PCR検査で単一のバンドが検出されないかなとも考えましたが、そういうキメラは凍結されていないでしょうね。
キメラだけでなく、もう一つ私の説ではたとえばＦＬＳは単一のＴＣＲ再構成を持つ幹細胞のはずなんですね。
①再構成されたT細胞
②再構成されていないT細胞
③FACS選別でわずかに混じり込んでくるB細胞等のリンパ球もしくはリンパ球以外の白血球等
②③の細胞がたまたま選ばれていたら普通のntESと同じ結果で、再構成の存在をもって、ntESであると実証する道はありません。でも①だった場合のみは、ちゃんと実験検証して、ntESだったら単一バンドがでますね。

[TCRの件30]
今更そんな検証実験を理研がやってくれるとも思えませんね。受精卵ESであるかntESであるかの識別は相当に困難であるようですね。
例えば近交系マウスであるB6マウスの雌の受精卵から受精卵ES細胞を作る。同じマウスの尻尾の体細胞からリシピエント卵もB6を使ってntESを作る。この二つをそれぞれ識別できるＤＮＡ解析方法はありません。ＤＮＡ配列は全部同じでSNPsも同じで、nonコードDNA領域も識別に使えない。mtDNAのヘテロプラスミーによる識別方も使えない。T細胞を使った今回の特殊な実験でのみ場合によって識別できるということですね。RNAの発現解析によってのみ、おおまかな識別が出来そうですがＥＳ細胞とntES細胞のＲＮＡ発現を細かく調べた研究もありませんよね。レター論文で我々がもたもたするのはその所為ですね。

[TCRの件31]
ど素人の解明手法は搦め手からです。以上です。御批判願います。

1. 2019/06/02(日) 08:05:42|
2. 学さんブログ検討記録
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