一言居士の独言

博論第2章


草稿目次との対比
(11jigen引用箇所)
2.小細胞の単離
2.1序論 - 27
2.1.1幹細胞と小細胞 - 27
2.1.2幹細胞と球体形成 - 27
2.2実験 - 28
2.2.1小細胞の分離 - 28
2.2.2小細胞の特性 - 29
2.3結果 - 30

(11jigen非引用個所)
2.3.1単離細胞からの球体形成 - 30
2.3.2トリチュレーション効果 - 30
2.3.3小細胞の培養条件 - 31
2.3.4骨髄細胞からの球体形成 - 31
2.3.5未熟細胞マーカー発現 - 32
2.3.6胚的表現型の発現 - 33
2.3.7多能性マーカーの定量PCR - 34
2.4第二章のまとめ - 35
2.5討論 - 35
2.6参考文献 - 45

(原文)
2. ISOLATION OF SMALL　CELLS

2.1 Introduction

2.1.1 Stem cells and small cells
Generally speaking, stem cells are small. The ratio of cytoplasm and nuclear is one of remarkable indexes of stem cells. However, the isolation method of only small cells is yet established.

(和訳)
2.　小細胞の単離

2.1　序論

2.1.1　幹細胞と小細胞
一般的に言えば、幹細胞は小さい。細胞質と核の割合は幹細胞の顕著な指標の一つである。しかし、小細胞だけの単離方法はもう確立されている。

(原文)
2.1.2 Stem cells and sphere formation
Sphere formation is recognized as one of the results of stem cell property since stem cell is recognized that they have strong proliferative potential and self-renewal potency. Recently, many reports demonstrated that various adult tissues contained sphere forming cells. Cells derived from many adult tissues, including retina, brain, cornea, olfactory neuroepithelium, pancreas, skin, muscle and bone marrow have been propagated as non-adherent clusters or spheres, as have embryonic stem cells.
Cells contained within the spheres described in those reports, exhibit neural lineage markers and appear to possess varying degrees of stem cell potency. We believe that adult stem cells described in various reports represent the same adult stem cells at different stages of development, expressing different degrees of potency. Sphere forming cells are much more immature than previously expected. We hypothesized that adult stem cells procured from any tissue, endoderm, mesoderm or ectoderm, could demonstrate a wide multipotency and cross germ layers when maintained in appropriate environments. Therefore, we first investigated how to isolate small cells. And then we examined if they had sphere forming potency in the serum-free condition.

(和訳)
2.1.2　幹細胞と球体形成
幹細胞が強い増殖能力および自己再生能力を持っていることが認識されて以来、スフィア形成は幹細胞特性の結果の一つとして認識されている。最近では多くの報告が、様々な成体組織がスフィア形成細胞を含むことを示している。網膜、脳、角膜、嗅覚神経上皮、膵臓、皮膚、筋肉および骨髄を含む多くの成人組織に由来する細胞が、胚性幹（ＥＳ）細胞がそうであるように、非付着性のクラスタ又はスフィアとして増殖されてきた。
これらのレポートに記載されているスフィアに含まれる細胞は神経系統マーカーを発現し、幹細胞能力の様々な程度を保有するように見える。我々は様々な報告書に記載された成体幹細胞は発達の異なる段階での効力の異なる程度を表現する同一の成体幹細胞を表すと考えている。スフィア形成細胞は前もって予想されていたよりもはるかに未成熟である。我々は内胚葉、中胚葉または外胚葉からのどんな組織から獲得された成体幹細胞でも、適切な環境下で維持するとき、広い多能性を示し、胚葉を横断することができるという仮説を立てた。そこで我々はまず小細胞を単離する方法を検討した。そして次に無血清状態でスフィア形成能があるかどうか調べた。

(原文)
2.2 Experimentall<→Experiment>

2.2.1 Isolation of small cells
Bone marrow, lung, muscle and spinal cord tissues were procured from 3- to 4-week-old C57BL/6J mice as described below. Bone marrow was acquired by flushing femur and tibia with culture media using an insulin syringe. Cells were plated at 1x10^ cells/cm" in F12/DMEM (1:1, v/v) supplemented with 2% B27, 20ng/ml bFGF and lOng/ml EGF
To isolate small cells from murin bone marrow, the following three types of methods were examined.

(和訳)
2.2　実験

2.2.1　小細胞の分離
以下に述べているように骨髄、肺、筋肉および脊髄組織は3～4週齢のC57BL / 6Jマウスから入手した。骨髄はインスリン注射器を用いて培養液で大腿骨と脛骨を洗い出すことによって取得した。細胞は1×10^細胞/ cmで、2％B27、20ng/ mlのbFGF及び10ng/ mlのEGFを補充したF12/ DMEM（1：1、v / v）に播種した。
げっ歯類骨髄の小細胞を単離するために、以下の3種類の方法が試された。(訳注:murin bone marrowは難波氏が噛みついてmiceという言葉も知らないのかと疑義されたが、無論murinはmiceより広い概念だというだけで間違いではない。キンガ論文にも使われている言葉。小保方さんは細胞シートの研究でよくこの言葉を使っていたので、こう書いて置いたかもしれない。何しろ何よりもこれは草稿であった。)

(原文)
A. Cell sorter
Forward scatter was calibrated by size-defined beads. Less　than 8 micro meters in diameter cells were isolated.

B. Optimistic<→Osmotic> pressure
Bone marrow cells were exposed to low optimistic<→osmotic> pressure　liquid to destroy mature cells.

C. Trituration using thin-glass pipette
Standard glass pipettes were burned and stretched out to　make thin tips. Mature cells were passed through thin glass　pipettes many times and destroyed by mechanical stress.　Obtained small cells were cultured in serum free medium, and appeared spheres　were counted as a number of stem cells.

(和訳)
Ａ.　細胞ソーター
前方散乱はサイズ定義されたビーズにより調整された。直径8マイクロメートル未満の細胞が単離された。

Ｂ.　浸透圧<訳注:これも難波氏の噛みついたところ。単なる勘違いでお疲れというだけの話。無論osmoticの間違い。論文審査で直されるのでこれが草稿だという何よりの証拠の一つでもある。>
骨髄細胞は成熟細胞を破壊するために低浸透圧液体に曝された。

Ｃ.　細ガラスピペットを使用しての粉砕
標準ガラスピペットは細い先端を作るために焼かれて伸ばされた。成体細胞は細ガラスピペットを何度も通され機械的ストレスによって破壊された。得られた小細胞は、無血清培地で培養し、スフィアが幹細胞の数としてカウントされた。

(原文)
2.2.2 Characterization of small cells
Immunohistochemistry. Protein expression was assessed using　immunohistochemical techniques as described below. Each slide was incubated with　anti-c-kit rat monoclonal antibody, anti-Sca-1 rat monoclonal antibody or　anti-E-cadherin rat monoclonal antibody. After washing with PBS, the cells were　incubated with goat anti-rat IgG Texas Red-conjugated antibodies and goat anti-rat　IgG Fluorescein-conjugated antibodies. SSEA-1 and Alkaline phosphatase (AP)　staining was performed using the ES cell detection Kit
Single sphere RT-PCR. Single spheres were individually collected under the　microscope. Total RNA was extracted from each single sphere, and then subjected to　oligo-dT-primed reverse transcription (RT). RT-PCR was performed using TaqDNA　polymerase on an iCycler for 35 cycles.

(和訳)
2.2.2　小細胞の特性
免疫組織化学。タンパク質発現は下記に記された免疫組織化学法を用いて評価された。各ガラススライドはanti-c-kit rat monoclonal 抗体, anti-Sca-1 rat monoclonal 抗体または、 anti-E-cadherin rat monoclonal 抗体によって培養された。 PBSで洗浄後、細胞は　goat anti-rat IgG Texas Red-conjugated 抗体と goat anti-rat　IgG Fluorescein-conjugated 抗体で培養された。ES細胞検出キットを用いてSSEA-1およびアルカリホスファターゼ（AP）染色が行なわれた。<訳注:ピリオドが無い。ここも草稿である証拠の一つ。そもそも小保方さんはかなり粗忽な性格で、ケアレスミスはとても多い。博論の草稿を印刷するというのはいくら多忙でも粗忽すぎる。文章も切り貼りして校正するときに動詞が抜けたりする。>
単体スフィアの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応。単体スフィアが個別に顕微鏡下に集められた。全RNAが各単体スフィアから抽出され、次にオリゴdTプライミング逆転写（RT）が行なわれた。 RT-PCRはiCycler上のTaqDNAポリメラーゼを用いて35サイクル行われた。

(原文)
2.3 Results
2.3.1 Sphere forming from isolated cells
Trituration and optimistic<→osmotic> pressure produced spheres. Whereas, cell sorter did not　produced any spheres. Trituration produced most number of spheres. Therefore, we　utilized trituration as the isolation method of small cells.

(和訳)
2.3　結果
2.3.1単離された細胞からのスフィア形成
粉砕と浸透圧<ここでも続けてoptimisticとosmoticの取り違えがあるがoptimisticというのは楽観的という意味で誰でも知っている。こんな言葉とosmoticを取り違えたまま気づかないでいるということを疲れてるなと思わない人は悪意なだけの人。金をもらって悪口を書いている。>がスフィアを作った。一方、セルソーターはスフィアを作らなかった。<訳注:Whereasは副詞的に使用しているようだが前文とカンマとの関係がおかしい。草稿ということもあってこのような文章になっている。普通こういうところを読むと草稿だと気付くものだが難波氏や11jigenは悪意を持って読んでいるから気づかない。>　粉砕が最も多くスフィアを生産した。我々は粉砕法を小細胞の単離方法として採用した。

(原文)
2.3.2 Effect of trituration
After the trituration, the population of small cells was increased comparing to native bone marrow cells (Fig. 3A and B). However not all of cells over 8 micro meters in diameter disappeared. Triturated cells formed spheres during culture.Interestingly, spheres were consisted of only small cells (Fig. 3C). Thus, it was demonstrated that trituration enabled to culture and grow only small cells.

(和訳)
2.3.2　トリチュレーション効果
粉砕後、小細胞の集団は元の骨髄細胞と比較して増加した（図3AおよびB）。 しかし、直径8ミクロンを超える細胞のすべてが消失したわけではない。粉砕された細胞は培養中にスフィアを形成した。興味深いことに、球体は小さな細胞のみで構成されていた（図3C）。 したがって、粉砕は小細胞のみを培養増殖させ得たことが実証された。

1. 2019/08/24(土) 22:53:49|
2. 小保方さんの論文
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