一言居士の独言

(レター論文FI幹細胞記述のリヴュー)


もう一度レター論文のFI-SCの件に関する記述を検討しましょう。STAP幹細胞の後の説明です。
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We next examined whether an alteration in culture conditions could induce in vitro conversion of STAP cells into cells similar to trophoblast stem cells, which can be derived from blastocysts during prolonged adhesion culture in the presence of Fgf4. When we cultured STAP cell clusters under similar conditions (Fig. 2a; one cluster per well in a 96-well plate), flat cell colonies grew out by days 7–10 (Fig. 2b, left; typically in ~30% of wells). The Fgf4-induced cells strongly expressed the trophoblast marker proteins integrin α7 (Itga7) and eomesodermin (Eomes) (Fig. 2c, d) and marker genes (for example, Cdx2; Fig. 2e).

STAP細胞をTS培地で培養したらどうなるかを試したというところからですね。既述しているFigure 2-aとbの実験ですね。96ウェルプレートのそれぞれにSTAP細胞塊を1個ずつ置いた。最大30%までのウェルで平らな細胞塊が成長してきて、免染の結果、インテグリンα7とEomes蛋白とCDx2等の遺伝子マーカーを発現したというわけです。ここは既に確認したところです。
マテメソでは最大50%と書かれていて微妙にニュアンスが異なっている。
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Cell culture
STAP cells were generated from low-pH-treated CD45+ cells, followed by culture in B27 + LIF medium for 7 days, as described1. For Fgf4-induced stem-cell line establishment, STAP cell clusters were transferred to Fgf4-containing trophoblast stem-cell medium9 on MEF feeder cells in 96-well plates. In most cases (40 out of 50 experiments), colonies grew in 10–50% of wells in 96-well plates. In minor cases (10 out of 50 experiments), no colony growth was observed and/or only fibroblast-like cells appeared. The cells were subjected to the first passage during days 7–10 using a conventional trypsin method. Subsequent passages were performed at a split ratio of 1:4 every third day before they reached subconfluency.

で、本文の続きです。
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These Fgf4-induced cells with trophoblast marker expression could be expanded efficiently in the presence of Fgf4 by passaging for more than 30 passages with trypsin digestion every third day. Hereafter, these proliferative cells induced from STAP cells by Fgf4 treatment are referred to as Fgf4-induced stem cells. This type of derivation into trophoblast-stem-like cells is not common with ES cells (unless genetically manipulated)<13> or STAP stem cells.

30継代以上できたんですね。その結果ここで初めてFI-SCと名付けられた。これは遺伝子操作しないES細胞ともSTAP幹細胞とも違うと強調される。更にこう続く。
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In the blastocyst injection assay, unlike STAP stem cells, the placental contribution of Fgf4-induced stem cells (cag-GFP-labelled) was observed with 53% of embryos (Fig. 2f, g; n = 60). In the chimaeric placentae, Fgf4-induced stem cells typically contributed to ~10% of total placental cells (Fig. 2h and Extended Data Fig. 2a, b).

STAP幹細胞キメラは胎盤貢献しないが、FI-SCキメラは60匹の中で53%が胎盤貢献していたという。その胎盤への貢献度は最大10%程度だったと。
Figure 2-hは以下です。FACSでGFP細胞をソートした結果です。



そのリジェンドです。
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h, Quantification of placental contribution by FACS analysis. Unlike Fgf4-induced cells, ES cells did not contribute to placental tissues at a detectable level.

Extended Data Figure 2-bは以下です。



そのリジェンドは以下です。
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a, b, Immunostaining (cross-section) of placentae obtained in the blastocyst injection assay with GFP (constitutive)-labelled ES cells (upper) or Fgf4-induced stem cells (bottom). Brown shows pan-cytokeratin and red shows GFP (ES cell or Fgf4-induced stem cell contribution). Regions indicated in a are shown in b. Fgf4-induced stem cells contributed to all layers of placentae, whereas no contribution was observed with ES cells. a, Scale bars, 5 mm. b, Scale bars, 50 μm.

本文の続きです。
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Despite their similarities, we noted that Fgf4-induced stem cells also possessed some critical differences compared with blastocyst-derived trophoblast stem cells. First, Fgf4-induced stem cells exhibited moderate GFP signals and expressed a moderate level of Oct4 (Fig. 2b; moderate and low levels of immunostaining signals were also seen for Oct4 and Nanog proteins, respectively; Extended Data Fig. 2c), unlike conventional trophoblast stem cells that have little Oct4 expression (Fig. 2e). Second, unlike trophoblast stem cells, blastocyst-injected Fgf4-induced stem cells also contributed to embryonic tissues (in all cases that involved chimaeric placentae; n = 32), although the extent of contribution was generally modest (Fig. 2g).

上で60匹のキメラの内の53%が胎盤貢献していたと書かれていた。ここではそれが32匹と書かれている。つまり53%ですね。若山さんがFI-SCでキメラを作っているんです。そしてその胎児胎盤を渡している。小保方さんはそれを免染とGFP保有細胞をFAC選別することで調べた。
Extended Data Figure 2-c は以下です。




そのリジェンドは以下です。
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c, Pluripotent marker expression of Fgf4-induced stem cells. Scale bars, 50 μm.

遺伝子発現解析をしてこれは大変なことだと笹井さんは興奮しているわけです。遺伝子発現解析に驚いているのではない。遺伝子はいろいろと条件の変化によって発現形態を変えますから、いろんなマーカーが出ているから驚いているわけではないわけです。
そもそもこの細胞は酸浴させた体細胞で、多能性を獲得していて、その証拠にキメラが出来ているんです。そのキメラのできているSTAP細胞をあれこれと培地誘導した細胞でキメラを造ったら、一つには実際に胎盤貢献しているという実験結果が出たのと、もう一つは、その細胞の遺伝子解析をしたらTSマーカーとESマーカーとどちらも出ているから驚いている。最後のは付け足しです。キメラができたから仰天していて、その胎盤からGFPが出たからまた仰天した。ここをまず確認しないといけないんですね。遺伝子解析結果は従の従です。
我々はキメラは出来てないと見たわけです。ntES化によるいたずらだと。そして胎盤は光っていてはおかしい部分だけを選んでGFPのFACSソーティングを行ったかと疑義しているわけです。胎児側胎盤内血管とか卵黄嚢は胎児側の組織ですからそもそも光っていて当たり前です。光っていてはいけないのはラビリンス部分です。ここはESでは光らない。自然胚だと胎盤は母親側と胎児側の両方で形成されてくる。胎児のトロフォブラストがラビリンスに入り込む。でもESはもともとトロフォブラストを形成できないので、ESキメラの胎児側ラビリンスはリシピエント胚の中のトロフォブラストが形成に預かる。4Nでも同じで、このことは若山さんのところの特許申請書の説明にも書かれている。
大本の酸浴STAP細胞からキメラが出来ていなかったら、遺伝子解析結果に大した意味はありませんよね。ラビリンス以外の胎盤や、胎膜(漿膜・羊膜・尿膜) ではない卵黄嚢を調べてGFPがあったというのでは、遺伝子解析に意味は有りませんよね。遺伝子解析単独では何も言えてない。キメラが出来て初めて多能性細胞だと言える。ラビリンスが光って初めて、STAP細胞キメラやFI幹細胞キメラの胎盤貢献が証明される。あの写真がラビリンスだけの蛍光写真だとどうしてわかりますかね。
大事なのは確かにキメラになったということと、胎児側のラビリンスや、胎膜が光っているという証拠です。遺伝子発現解析結果ではない。

では、キメラもできてない、胎盤も光ってない、つまりいたずらと勘違いだったとして、この遺伝子解析結果は何を意味することになるのか。普通のESではないということは証明されていますね。この時の証拠こそ遺伝子解析結果以外にに無いわけです。キメラも胎盤蛍光も無かった。その細胞の遺伝子発現解析結果だけがある。
査読者のアドヴァイスによるJAKiの実験はこれがESでないことを証明してくれた。Figure 2-jはここで使われたFI-SCがESでないことを証明した。そして隣の2-kの実験は同じFI-SCにESでは出ない筈のCdx2,Eomes,Elf5,Itgα7が発現していて、かつES細胞はコンタミしてないことが示されている。可能性としてはTS細胞がコンタミしていたのではだったのではないかということだけです。
捏造しようとしていたのならGRAS提出試料とこの実験で使われた試料が同じという保証は有りません。この実験はTSで行われたのかもしれない。それは残存サンプルを解析しないと分かりませんよね。このサンブルは木星リストに残されていますね。桂地チームは調査してないですね。もう一度貼り付けましょう。





青文字の寺下さんの③④はFI-SCでしたね。ESのJAKi実験は(下段)の小保方さんの⑰⑱でした。従ってFI-SCと書かれていないが③④はそうなんですね。
(上段　8本)
①ES RNA 5/14 2本
②TS RNA 5/14 2本
③JAKi- RNA 5/14 2本
④JAKi+ RNA 5/14 2本

RNAサンプルですからCAGの人工遺伝子のRNAがあれば見つかりますね。TSでは無いとすぐわかる。

ところで、丹羽さんのCD1のTSにはGFPは入っていない。でも若山さんのTSにはGFPが入っている。「僕のマウス」TSですよね。自然胚に入れてTS細胞のGFPが光っている写真を比較用に撮ったものがあるはずなのに何も使われていない。これもおかしな話なんですけどね。

本文を読み進めましょう。
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Third, immunostaining revealed that the level of Cdx2 protein accumulation in the nuclei of Fgf4-induced stem cells was marginal as compared to the cytoplasmic level, although the transcript expression level was substantial (Fig. 2e). This may suggest complex and dynamic post-transcriptional regulations for this key transcription factor in Fgf4-induced stem cells (a similar situation was seen for STAP cells, in which clear nuclear localization was not observed for either Cdx2 or Eomes, despite substantial expression of their transcripts). Fourth, in the absence of Fgf4, Fgf4-induced stem cells gradually died in 7–10 days and did not differentiate into large and multi-nuclear cells, unlike trophoblast stem cells (Extended Data Fig. 2d).

まず先にこのCdx2に関しては私は今でも何か腑に落ちない感じがしています。ティシュー論文ではコントロールのESにCdx2があるんです。



左のFigure2はESと骨髄スフィアの3ライン、右のFigure3はESと脊髄、筋肉、肺のスフィアのPCR結果です。別々の実験でコントロールはその都度取られている。バンドの形が違います。
Cdx2はどちらのコントロールESにも出ています。これはネイチャー論文ではTSマーカージーンと定義されていて、STAP細胞からの発現はあるが、ES細胞からの発現はない。
恐らくティシュー論文の実験は定性分析だと思われる。ネイチャー論文では発現量も比較されている。
Oct4とCdx2は胚盤胞期以前はどちらも発現していて、インナーセルマスとトロフォブラストに分かれた時に、両側に分かれる。一方の発現を押さえる蛋白質があって、外側にあるか内側に有るかの位置関係で発現が決まる。
でも理屈ではそうなっているがでは、ES細胞にはCdx2はゼロかというとそんなこともない。わずかには有りますね。





ティシュー論文の図は間違いではないが、遺伝子発現解析に何を求めるかということですね。ES特異的マーカーとは何かということを問うのなら定量的に調べないと有意なことが言えないということになる。ティシュー論文は小保方さんの初期論文ですから、主旨を取るならESマーカーであるOct4がスフィアにも出ていると素直に読むべきなんでしょうけどね。

本文に戻って、細胞質内と核内との違いのデータはないですね。the level of Cdx2 protein accumulation in the nuclei of Fgf4-induced stem cells was marginal as compared to the cytoplasmic levelということを示す図が無い。この2-eは定量PCR結果ですね。後ろの although the transcript expression level was substantial (Fig. 2e)に対応している。そもそも核内にprotein accumulationなんてあるわけないですよね。核内では関係遺伝子が転写されてRNAが作られ、それが核外に出た細胞質内でたんぱく質が作られる。図もない上に言ってることがおかしい。
後ろに続くこの文章も全く意味が分からない。
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This may suggest complex and dynamic post-transcriptional regulations for this key transcription factor in Fgf4-induced stem cells (a similar situation was seen for STAP cells, in which clear nuclear localization was not observed for either Cdx2 or Eomes, despite substantial expression of their transcripts).

染色で出ないと言ってるのだとしたらそれは当たり前ですけどね。これって笹井さんが一から書き直したと言ってるんでしょ。


Extended Data Figure 2-dは以下です。



リジェンドです。
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d, e, Effects of Fgf4 withdrawal from Fgf4-induced stem cell culture. Unlike trophoblast stem cells (d, left), which generated multi-nucleated large cells (arrow) in the absence of Fgf4, Fgf4-induced stem cells (d, right) simply stopped proliferation and gradually died on Fgf4 withdrawal. Scale bars, 50 μm. This finding suggests that placental differentiation of Fgf4-induced stem cells in vivo may involve more than just Fgf4 signal suppression.


胎盤は筋肉と同じで多核細胞なんですね。TS細胞はFgf4を排除すると分化を始めるが、FI-SCは同様の処置では死滅する。従って胚の中では更に何かがあって分化し始めるのであろうという推測ですね。そもそも胎盤貢献してたのかという疑義が無い場合の話です。

桂報告書は太田ESだと言ってる。太田ESをFgf4入りのTS培地で誘導して見たらいいのにね。受精卵ESをTS培地で培養は出来ないと思うけどな。我々はntESだと思っている。Ts.Marker さんは新手の多能性細胞だと。

まあ、若山さんに太田FES1を使ってFI-SCを再現してもらおう。

取り敢えずFI-SCの特徴は4つでした。
①従来のTSはOct4タンバクを発現しないがFI-SCは発現する。
②FI-SCはキメラの胎盤のみならず胎児にもわずかながら貢献する。
③FI-SCの核内にはCdx2タンバクの蓄積が無い。(私の知識レベルだと当たり前なのだが?)
④TSと異なりFgf4を抜いただけでは分化を始めず、試験管内では死滅する。


さて、もう少し先まで読み進めましょう。
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To investigate the relationship among STAP cells, STAP stem cells, Fgf4-induced stem cells, ES cells and trophoblast stem cells, we performed genome-wide RNA-sequencing analysis (Fig. 2i for dendrogram; Extended Data Figs 3 and 4 for expression analyses of representative genes　; Supplementary Tables 2 and 3 for analysis conditions). Whereas STAP cells formed a cluster with STAP stem cells, Fgf4-induced stem cells, ES cells and trophoblast stem cells and not with the parental CD45+ cells, STAP cells were an outlier to the rest of the cell types in the cluster. In contrast, STAP stem cells were closely clustered with ES cells. Fgf4-induced stem cells formed a cluster with a sub-cluster of ES cells and STAP stem cells, whereas trophoblast stem cells comprised an outlier to this cluster, indicating a close relationship of Fgf4-induced stem cells with these pluripotent cells.


まあ、これがものすごいんですよね。CD45+細胞とTSとESは別としてすべてが皆異なった遺伝子発現になっているんですよね。Ts.Marker さんや学さんがレター論文の実験を見たらSTAP現象は有るのだと主張したくなる理由がこれなんですよね。何はともあれすべてが違っているということです。多能性の問題以前の話ですね。それぞれが別の種類の細胞だということです。






でも、忘れないでくださいよ。これはSTAP現象があるという証拠ではない。細胞がそれぞれ別の発現をしているということだけです。多能性を証明しているのは以下の二つの実験事実です。
①キメラができた。
②胎盤が光った。
この二つの信憑性に疑義があるとその段階でただ単になんかいろんな細胞があるねと言うだけの話になる。



リジェンドです。
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i, Cluster tree diagram from hierarchical clustering of global expression profiles. Red, approximately unbiased P values.

ちょっとデンドログラムはど素人の私には歯が立たない。

先に進みましょう。
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However, as Fgf4-induced stem cells lay between STAP stem cells and trophoblast stem cells in the dendrogram, the possibility of contamination of STAP stem cells in the Fgf4-induced stem-cell population cannot be ruled out. Previous studies have indicated that inner cell mass (ICM)-type pluripotent cells can be removed from culture by treating the culture with a JAK inhibitor <16>(Extended Data Fig. 5a, b). In contrast, the JAK inhibitor treatment had no substantial effect on Oct4-GFP expression in Fgf4-induced stem-cell culture (Extended Data Fig. 5c, d; see Extended Data Fig. 5e, f for control). Expression of neither pluripotency markers (Fig. 2j) nor trophoblast markers (Fig. 2k) was substantially affected, indicating that pluripotency marker expression is unlikely to reflect contaminating STAP stem cells (ICM-type). Consistent with this idea, Fgf4-induced stem cells that were strongly positive for the trophoblast marker Itga7 (a surface marker for trophoblasts but not ES cells) also expressed high levels of Oct4-GFP (Extended Data Fig. 5g).

ネイチャー査読者はES細胞がコンタミしてないことをJAKi検証しろと指示したんですが、笹井さんはSTAP幹細胞がコンタミしている可能性があるから調べたと書いた。ここはESのコンタミはしていないということを書くこと自体が恥ずかしいレベルなんですよね。だからそれをSTAP幹細胞がコンタミしていたらいけないからJAKi検証したとレトリックを使ったんですが、JAKiで取り除けるのは(ICM)-type pluripotent cellsですから、STAP幹細胞は(ICM)-typeではないので矛盾している。でもこれでJAKiを使ってESは入っていないと証明しましたから査読者のご機嫌は損ねていない。
コントロールのESコンタミというのは恥ずかしいレヴェルだというのは以前のサイエンスの査読に以下のような表現があるのでわかる。(2)は若山研をあからさまに馬鹿にしてますよね。尤もそれくらい信じられない報告でもあったということです。
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This is such an extraordinary claim that a very high level of proof is required to sustain it and I do not think this level has been reached. I suspect that the results are artifacts derived from the following processes: (1) the tendency of cells with GFP reporters to go green as they are dying. (2) the ease of cross contamination of cell lines kept in the same lab.

[ In contrast, the JAK inhibitor treatment had no substantial effect on Oct4-GFP expression in Fgf4-induced stem-cell culture (Extended Data Fig. 5c, d; see Extended Data Fig. 5e, f for control).]の部分は既述しているように私の持っているFig. 5e, fではFI-SCのOct4-GFPのグリーン蛍光は左右ともに無い。でも本文の論旨では左右ともに、つまりKAKiが無くてもあってもグリーン蛍光している写真であるはずです。ここは自分の持っている写真ではそれが分からないということ以上には言えない。
ただし、gはOct4-GFPのFI-SCがあったという証拠で、無かったら、小保方さんの捏造ですよね。ところが、桂報告は無いと書かずに、若山さんが作った記憶が無いと証言したことを記しているだけです。この鋭い対立点をどうしてぼやかすのか。どちらが嘘をついているのでしょうかね。Extended Data Figure 5-gとそのリジェンドは以下です。




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g, FACS analysis of integrin α7 expression in Fgf4-induced stem cells. Over 40% of Fgf4-induced stem cells strongly expressed both the pluripotency marker Oct4-GFP and the trophoblast marker integrin α7. The bottom panel shows an isotype control for integrin α7 antibody. In ES cells, integrin-α7-expressing cells were less than 0.1% (data not shown; three independent ES cell lines were examined).

小保方さんがどうしてOct4-GFPでなくてOct4そのものでFACSしなかったかということは以前から気にはなってるんですけどね。一度もGFPのアーティファクトは疑わなかったんでしょうね。ただし、そのことによって、Oct4-GFPのFI-SCはあったという証明がここにあって、事実が無かったのだったら、これは小保方さんの捏造を証明する。しかし、事実あったか否かは、記憶が無いとされているだけです。
調べられていないFI-SCの残存試料は木星リストにたくさんある。AC129-14で既述しています。

先に進みましょう。
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Notably, when cultured in LIF+FBS-containing medium for 4 days, Fgf4-induced stem cells underwent substantial changes in morphology and started to form ES-cell-like compact colonies with strong GFP signals (Fig. 3a). These cells showed expression of pluripotency makers, but not trophoblast markers (Fig. 3b and Extended Data Fig. 6a), and formed teratomas in mice (Extended Data Fig. 6b). These ES-like cells were generated from Fgf4-induced stem cells sorted for strong expression of the trophoblast marker Itga7, but rarely from Itga7-dim cells (Fig. 3c, d).

いよいよ、Expandable ES-like cells です。若山さんは関さんに僕はあんなことは言ってないし、実験もしてないと主張したそうですが、それなら発表前に抗議すべきでしょうという批判はさておいても、小保方さんが持っていたFI-SCをLIF培地に戻すなり、笹井さんがそう指示したりしたとしても、Oct4-GFPを発現しだしてES-likeに戻ったというのは本当だということになる。これが嘘なら小保方さんの捏造です。ここでもGFPが光ったというのですからGOF由来のFI-SCは有るのでないといけない。
Figure 3-aは以下です。



リジェンド。
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a, Culture of Oct4-GFP Fgf4-induced cells in LIF + 20% FBS medium.


Figure 3-bです。完全にESに戻っている。



リジェンドは以下です。
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b, qPCR analysis of ES-like cells derived from Fgf4-induced cells for pluripotent marker genes (left) and trophoblast marker genes (right). Values are shown as ratio to the expression level in ES cells (left) or trophoblast stem (TS) cells (right).

FI-SC状態の時はFigure 2j,kでしたね。もう一度貼り付けましょう。



グラフとか写真は簡単に捏造できます。小保方さんが捏造していたら何もかも捏造していることになりますね。言い訳はできません。ESの増殖率表とか、メチル化実験のサンブルの選別なんていうレベルの話ではありません。このFI-SCに関しては何もかも捏造していて、GOF由来FI-SCがないのですからすべてのデータを捏造していることになる。しかも若山さんがそれを見ているにも関わらず平気で嘘データを並べ立てていることになるんですね。
桂チームは何をしてたんでしょうかね。小保方さんのこの悪辣さをよく放置できましたね。

丹羽さんは小保方細胞をプロトコルに書かれた培地で誘導しようとしましたができずに、最終的には全部死滅してしまいました。桂報告書はFI-SCは太田細胞FES1だと結論しましたから、太田ESをプロトコルのTS培地で培養して見たらよかったんでしょ。というよりそんなことすら試さないで何を主張しているんでしょうかね。

Extended Data Figure 6-a,bは以下です。



リジェンドです。テラトーマは木星リストの20番にありましたね。既述です。
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a, Immunohistochemistry of ES-like cells for trophoblast and pluripotency markers. ES-like cells converted from Fgf4-induced stem cells no longer expressed the trophoblast marker (integrin alpha 7), but they did express the pluripotency markers (Oct4, Nanog and SSEA-1). Scale bar, 100 μm. b, Pluripotency of ES-like cells converted from Fgf4-induced stem cells as shown by teratoma formation. Those cells successfully formed teratomas containing tissues from all three germ layers: neuroepithelium (left, arrow indicates), muscle tissue (middle, arrow indicates) and bronchial-like epithelium (right). Scale bar, 100 μm.


Figure 3-c,dは以下です。Plating efficiancyというのが何かはよくわからないが、要するに6%から9%くらいのOct4-GFPコロニーが形成されるということらしい。Itgα7のディムでも少しは出来ると。
ここのコントロールのESの8%の意味が良く分からない。




リジェンドは以下。
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c, d, Culture of Oct4-GFP Fgf4-induced cells sorted by FACS for strong integrin α7 (Itga7) expression in LIF + 20% FBS medium. d, Formation frequency (shown by percentage) of Oct4-GFP+ colonies from cells plated on gelatin-coated dishes at a clonal density. **P < 0.01; t-test; n = 3.


ストロングとディムとESとを並べて同じLIF培地に入れたんでしょ。ESは100%蛍光しないとおかしいのではないかな。それとこの時のESは誰に提供してもらったものかな。笹井さんと丹羽さんは小保方さんが学生のGOF-ESしか持ってないことを知っていたかな。もしも小保方さんがntESも受精卵ESも同じだと考えていて、それを笹井さんと丹羽さんが知らずに、小保方さんが学生のntESをここでコントロールとして使ったのだとしたら、FI-SCはntESだと分かるところなんですけどね。何しろ桂チームは何も調べてない調査チームですからね。

本文の続きです。
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To confirm further that Fgf4-induced stem cells with a trophoblast-like nature were converted into ES-like cells, rather than just selecting ES-like cells pre-existing in the Fgf4-induced stem cell culture, we examined the effect of the MEK inhibitor PD0325901 on the ES-like cell generation from Fgf4-induced stem cells. Like trophoblast stem cells, Fgf4-induced stem-cell survival is dependent on FGF–MEK signals, and the inhibition of MEK activity caused massive cell death (Extended Data Fig. 6c). However, PD0325901 is also known to be a main effector in 2i medium[17] and to promote ES cell maintenance. Addition of PD0325901 to LIF+FBS-containing medium strongly inhibited the formation of ES-like colonies from Fgf4-induced stem cells (Fig. 3e, left, and Fig. 3f). This inhibition was unlikely to be due to secondary toxic effects from massive cell death of Fgf4-induced stem cells, as colonies formed in the presence of PD0325901 when ES cells were co-plated in the same culture with Fgf4-induced stem cells (Fig. 3e, right, and Fig. 3f).

FI-SCからExpandable ES-like cells に転換するときにそもそもFI-SCの中にあらかじめ存在していたExpandable ES-like cellsが選択されたのではなくてTS-like nature を持ったFI-SCから培地誘導によってエピジェネティク制御が転換されたのだということを証明したいということですね。
ここも又よくわからないところで、仮にTS-likeとES-likeが共存しているような細胞だと思ったら先にそのこと自体を研究して事実を確定させるんじゃないのかなあ。
ただ、こういう視点でFI-SCは何にでもなるんだよという現象報告をしている段階なのだということなら、それは別にやってはいけないなんてことはないんだからやるんだろうなと、我々ど素人は思うだけだですね。自分の仕事の分野でこういうケースに出会ったらとことん調べるけどな。そうでないと気持ちが悪い。
小保方さんはデータを渡されて論文にしてくれと指示されただけだし、笹井さんは論文が通るように手伝ってくれと頼まれているだけで、そのものを研究しているわけではない。この幹細胞化論文というのはとてつもなくおかしい論文で、そもそも若山さんが自分で書くべき論文です。小保方さんに書いてくれと言ったのは、自分と一緒に山梨大についてきてくれという意味ですよね。
理研がこの事件を曖昧にしたがっているのは、こんな私的な事柄を世間に引っ張り出してさらしてしまった直接の原因が自分にあるからなんですね。小保方さんを採用しなかったら事件は無かった。
ここは既に我々には分かり切っているところですね。手記も読まないでこの件に関して何か論じるなんて間抜けな話です。悪党かアホかのどちらかだ。
まあ、それはさて置いて、あらかじめ存在しているかもしれない ES-like cellsがあるかどうかを調べるために、MEK inhibitor PD0325901を使ってみたという。あれ、JAKiではいけないのか。こちらはES細胞を除去するものでした。MEK inhibitor PD0325901はTS-like natureの細胞を殺し、ES-like　natureの細胞を増殖させるという。この実験をしろという査読者の指示は最初のリヴァイズ時の査読書にはありまません。後でどういう指示が加わったのかは分かりません。ただ、小保方さんが思いつくような実験とは思えませんね。小保方さんはESとかTSはよく知らない。だからこそ若山さんのところにキメラ作成依頼に来ている。ESもTSも自分の手で作ったことはありません。笹井さんと丹羽さんがアドヴァイズしている。


Extended Data Figure 6-c は以下です。MEK inhibitor PD0325901を入れたらFI-SCが死滅したという実験証拠です。




リジェンドは以下。
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c, MEK inhibitor treatment assay for Oct4-gfp Fgf4-induced stem cells in trophoblast stem-cell medium containing Fgf4. No substantial formation of Oct4-GFP+ colonies was observed from dissociated Fgf4-induced stem cells in MEK-inhibitor-containing medium. Scale bar, 100 μm.

でも、これって、死滅したという証拠写真になってませんね。本文には死滅した写真ということになっている。でもこの写真の上の写真はブライトフィールドですよね。そして下の写真はOct4-GFP発現写真で、リジェンドにはOct4-GFP細胞塊が出現しないと書いている。
TS-like nature の細胞は死滅して、ES-like nature の細胞があれば増殖するはずなんですから、理屈はあってるんですけど、写真はそれでは立証したことになってない。まず、ブライトフィールドで細胞があるということを示し、次にそのGFP発現写真を並べた後に、MEKiを入れたらどう変化したのかの写真が必要です。そもそもFI-SCはOct4も少ないながら発現しているんですよね。小保方さん疲れてましたかね。

で、本文後半部、Figure 3-e,f は以下です。




リジェンドは以下。
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e, f, Culture of Oct4-GFP Fgf4-induced cells (dissociated) in LIF + 20% FBS medium with MEK inhibitor. **P < 0.01; NS, not significant; Tukey’s test; n = 3.
e, No substantial formation of Oct4-GFP+ colonies was seen from Fgf4-induced cells in the presence of MEK inhibitor (left), whereas colonies frequently formed when cells were co-plated with Oct4-GFP ES cells (right; plated cells were 1/20 of Fgf4-induced cells). f, Quantification of colony formation per plated cells (1 × 103 Fgf4-induced cells and/or 1 × 103 ES cells). Unlike Fgf4-induced cells, ES cells formed colonies (regardless of co-plating with FI-SCs) in the presence of MEK inhibitor. Bars and error bars represent mean values and s.d., respectively (b, d, f). Scale bars: 100 μm (a, c, e).

これもMEKiを入れてない状態でのOct4-GFP発現状態の写真が無い。

そもそもこの実験で使われているGOF由来FI-SCは何なのか? あったのか、なかったのか。


若山さん。あなた論文の発表記者会見場に責任著者としていたよね。これって、GOFのFI-SCが無いのなら、ここまで放置していたあなたの捏造論文だよな。8月に責任著者を降りたいと言った時なぜ本当のことを言わなかったの。GOFのFI-SCがないのなら、ここにある実験はすべて捏造だ。あなた、論文は通るはずが無いと信じていたね。或いは祈るように願っていた。


さて、本文に戻りましょう。
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Here we demonstrate that STAP cells, which have a limited self-renewal ability, can be induced to generate two distinct types of robustly self-renewing stem cells—STAP stem cells and Fgf4-induced stem cells—under different culture conditions. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) sequencing analysis showed distinct accumulation patterns of modified histone H3 in the two types of STAP-cell-derived stem cells (Fig. 4b). STAP stem cells (as well as STAP cells) had accumulation patterns of H3K4 and H3K27 trimethylation that resembled those of ES cells at the loci of pluripotency marker genes (Oct4, Nanog, Sox2), bivalent pattern genes18 (Gata2, brachyury, Nkx6-2) and trophoblast marker genes (Cdx2, Eomes, Itga7). In contrast, the accumulation patterns in Fgf4-induced stem cells at these loci matched more closely those of trophoblast stem cells, except that low levels of accumulation of H3K4 trimethylation in Oct4 and Nanog and of H3K27 trimethylation in the trophoblast marker genes were observed in Fgf4-induced stem cells but not trophoblast stem cells.

Figure 4は以下です。何度でも貼り付けましょう。4-bはTs.Markerさんによって再確認されている。




ChIP-Seqのデータは公共データベースに登録されている。丹羽さんのTS以外は2012年の8月の分です。丹羽さんの分は若山さんのTSが分化していたようなので丹羽さんが提供した。

ChIP-Seq
①SRR1171553　小保方　CD45 positive Cells:ChIPSeq.H3K27me3　derived from spleen　Oct3/4::gfp C57BL/6　GOF
②SRR1171554　小保方　CD45 positive Cells:ChIPSeq.H3K4me3　derived from spleen　Oct3/4::gfp C57BL/6　GOF
③SRR1171555　小保方　CD45 positive Cells:ChIPSeq.input　derived from spleen　Oct3/4::gfp C57BL/6　GOF
④SRR1171562　若山　Embryonic Stem Cells:ChIPSeq.H3K27me3　C57BL/6x129/Sv
⑤SRR1171563　若山　Embryonic Stem Cells:ChIPSeq.H3K4me3　C57BL/6x129/Sv
⑥SRR1171564　若山　Embryonic Stem Cells:ChIPSeq.input　C57BL/6x129/Sv
⑦SRR1171567　若山　FI-SC(Fgf Induced Stem Cells):ChIPSeq.H3K27me3　Oct3/4 expressing cells　C57BL/6x129/Sv　129xB6-Acr-CAG
⑧SRR1171568　若山　FI-SC(Fgf Induced Stem Cells):ChIPSeq.H3K4me3　Oct3/4 expressing cells　C57BL/6x129/Sv 　129xB6-Acr-CAG
⑨SRR1171569　若山　FI-SC(Fgf Induced Stem Cells):ChIPSeq.input　Oct3/4 expressing cells　C57BL/6x129/Sv　129xB6-Acr-CAG
⑩SRR1171582　小保方　Low pH treated CD45 positive Cells:ChIPSeq.H3K27me3　Oct3/4 expressing cells　C57BL/6x129/Sv 　129xB6-CAGヘテロ
⑪SRR1171583　小保方　Low pH treated CD45 positive Cells:ChIPSeq.H3K4me3　Oct3/4 expressing cells　C57BL/6x129/Sv　129xB6-CAGヘテロ
⑫SRR1171584　小保方　Low pH treated CD45 positive Cells:ChIPSeq.input　Oct3/4 expressing cells　C57BL/6x129/Sv　129xB6-CAGヘテロ
⑬SRR1171587　若山　STAP-SC(STAP derived Stem Cells):ChIPSeq.H3K27me3　Oct3/4 expressing cells　C57BL/6x129/Sv　129xB6-CAGヘテロ
⑭SRR1171588　若山　STAP-SC(STAP derived Stem Cells):ChIPSeq.H3K4me3　Oct3/4 expressing cells　C57BL/6x129/Sv　129xB6-CAGヘテロ
⑮SRR1171589　若山　STAP-SC(STAP derived Stem Cells):ChIPSeq.input　Oct3/4 expressing cells　C57BL/6x129/Sv　129xB6-CAGヘテロ
⑯SRR1171592　丹羽研　Trophoblast Stem Cells:ChIPSeq.H3K27me3　CD1
⑰SRR1171593　丹羽研　Trophoblast Stem Cells:ChIPSeq.H3K4me3　CD1
⑱SRR1171594　丹羽研　Trophoblast Stem Cells:ChIPSeq.input 　CD1


報告書(スライド)の疑義は既述です。1月最終とは何か。



Ts.Marker さんの再確認図も保存のために添付しておきましょう。あちこちに置いておかないといつ何が有るか分からない。
横列、上段Oct4,Nanog,Sox2、下段Cdx2,Eneos,Itgα7の並び。
縦列は以下。
⑤SRR1171563　若山　Embryonic Stem Cells:ChIPSeq.H3K4me3　C57BL/6x129/Sv
⑪SRR1171583　小保方　Low pH treated CD45 positive Cells:ChIPSeq.H3K4me3　Oct3/4 expressing cells　C57BL/6x129/Sv　129xB6-CAGヘテロ
⑭SRR1171588　若山　STAP-SC(STAP derived Stem Cells):ChIPSeq.H3K4me3　Oct3/4 expressing cells　C57BL/6x129/Sv　129xB6-CAGヘテロ
⑧SRR1171568　若山　FI-SC(Fgf Induced Stem Cells):ChIPSeq.H3K4me3　Oct3/4 expressing cells　C57BL/6x129/Sv 　129xB6-Acr-CAG
⑰SRR1171593　丹羽研　Trophoblast Stem Cells:ChIPSeq.H3K4me3　CD1





Ts.Marker さんはbivalent pattern genes (Gata2, brachyury, Nkx6-2) は調べてない。小保方さんはESとSTAP細胞を間違えて図に示しているが、実際には持ち込むときに既にラベルを間違えていて、論文に図示するときに気づいて訂正している可能性がある。なぜなら、桂報告書はSTAP細胞はFES1という受精卵ESだと言っている。STAP細胞の方がNanogの発現量が多いことになる。
この時点で若山さんはFigure 4-bのESとSTAPが入れ代わっているので間違いだから論文の取り下げと言った。そして、後にはSTAPは太田ESだと言い出した。でもこのFI-SCにESマーカーがわずかに出ていることをどう説明するのかというTs.Marker氏の質問には誰も答えない。

私はntES化したもので、ntESの知られていなかった性質だと推測した。それでキメラが出来ている理由も説明でき、小保方さんが精神異常者だというあり得ない可能性も考えなくてよくなり、まして若山さんは別の実験をしていただけだから、そもそも捏造なんて考えもしてなかったのだという、ごく常識的な判断が可能になる説明をした。
それに対して、Ts.Marker氏は小保方細胞はキメラの出来る細胞であったし、共培養用によって、幹細胞化もできたのだと解釈したが、それならできている事実をどうして発表後に取り下げたのかの説明をしなければならないと再三我々が要請しているのに、今のところ答えられていない。学氏に至っては実験ミスだったと言い出す始末で、それは出来ない側の立場になり、キメラがどうして実験ミスでできたのかというとESコンタミしか考えられなくなり、事故コンタミの可能性は細胞を解凍するいう行為自体が意図を証明しているのであり得ない以上、擁護派として支離滅裂と批判されている。


本文に戻りましょう。
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Recent studies have also begun to reveal dynamic regulations in multiple cellular states related to pluripotency. These include reports of co-expression of Oct4 and Cdx2 in rat ES cells maintained in the presence of a GSK-3β inhibitor[19][20] and of Oct4 expression in rat extra-embryonic precursors[21].Another recent study has indicated that conventional ES cell culture also contains a very minor population of Oct4− cells with features resembling those of very early-stage embryos, including bidirectional potential[22]. However, these cells are dissimilar to STAP cells as they are Oct4−, unlike STAP cells and Fgf4-induced stem cells. Our preliminary genome-wide RNA-sequencing analysis indicated that both morulae and blastocysts are outliers to the cluster of STAP and ES cells (Extended Data Fig. 6d–f and Supplementary Tables 4 and 5).


ここでもOct4-GFPのFI-SCがあることになっている。Extended Data Figure 6-d,e,fは以下です。



リジェンドは以下。
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d, Cluster tree diagram from hierarchical clustering of global expression profiles. Red, AU P values. As this analysis included morula and blastocyst embryos from which only small amounts of RNA could be obtained, we used pre-amplification with the SMARTer Ultra Low RNA kit for Illumina Sequencing (Clontech Laboratories). e, f, Volcano plot of the expression profile of STAP cells compared to the morula (e) and blastocyst (f). Genes showing greater than 10-fold change and P value 1.0 × 10(to the power of−6 )are highlighted in red and are considered up- (or down-) regulated in the STAP cells.


正直この実験は何をやってるのか知識不足で分からない。Supplementary Tables 4 and 5は蛋白質の発現表だが、これも知ってるのはCdx2だけしか無くて何を意味しているのか理解できない。

本文最後です。
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A key conclusion drawn from this study is that the reprogramming in STAP conversion goes beyond the pluripotent state of ES cells and involves the acquisition of a wider developmental potential related to both ICM- and trophoectoderm-like states. Because of the inability to clone STAP cells from single cells, we must await future technical advancement to examine whether their dual-directional differentiation potential at the population level may reflect one totipotent state at the single-cell level or two different states of STAP cells coexisting (or fluctuating between them) in culture. As for STAP-cell-derived Fgf4-induced stem cells, which can also contribute to both embryonic and placental tissues, our in vitro conversion study combined with inhibitor treatments clearly indicate that the bidirectional potential of Fgf4-induced stem cells is unlikely to reflect the co-presence of separate subpopulations of ES-like and trophoblast-stem-like cells in the culture. Collectively, our study indicates that STAP-based conversion can reprogram somatic cells to acquire not only pluripotency but also the ability of trophoblast differentiation.


笹井さんは記者会見時の記者の質問に対して、疑義が生じているのはアーティクル論文であって、自分の纏めたレター論文ではないと答えました。彼はここに書かれている通りに信じていたのです。そして丹羽さんもそう信じていた。しかし、若山さんはGOFのFI-SCを作った記憶が無いと後に言い出した。何を言ってるのか。レター論文の実験はGOFのFI-SCが存在しなければできない実験ではないか。責任著者が何をいまさらそんなことを言いだしているんだ。論文を一度も読んで無かったとでも言うのか。読みもしないで自分でも理解できない論文になっていたと笹井さんに言ったのか。存在しないFI-SCの実験を行ったと論文のあちこちに書いている小保方さんの嘘をずっと放置していたとでもいうのか。何をとぼけたことを言ってるんだ。お前は責任著者だろうが。

それともGOFのFI-SCは作られていて、小保方さんにそう言って渡していたのか。キメラが小保方細胞核のntES化によって作られている嘘を白状できなくなってしまったから、GOFのFI-SCは作って無いと説明したのか?

1. 2019/12/25(水) 11:43:26|
2. AC129
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