(英文)
In the case of liver cells, when 5 × 10
cells were seeded in a well of 12 well plate, 20–30 aggregates were observed after seven days on average (Fig. 2b). Addition of fibroblast growth factor (Fgf)-2, based on personal communication with the authors of the 2014 reports, slightly enhanced cell agregate formation. Since the culture medium contains leukemia inhibitory factor (LIF), which shows differential action on ES cells derived from different genetic backgrounds[12], we suspected that the genetic background might affect aggregate formation. However, as shown in Fig. 2c, although it was known that the 129 background confers a dominant effect in obligating the LIF signal input to maintain pluripotency[12], there was no difference between C57BL6 and C57BL6 × 129 F1 (either C57BL6/129 or 129/C57BL6) in the observed frequency of aggregate formation in the present study.
肝臓細胞の場合、5×10の5乗個の細胞を12ウェルプレートのウェルに播種すると、平均して7日後に20～30個の凝集物が観察された (Fig. 2b)。 2014年の報告書の著者との個人的な連絡に基づく線維芽細胞増殖因子（Fgf）-2の添加は、細胞の凝集形成をわずかに増強した。 培養培地には、様々な遺伝的背景に由来するES細胞に異なる作用を示す白血病抑制因子（LIF）が含まれているため、我々は遺伝的背景が凝集体形成に影響を及ぼす可能性があると考えた。 しかしながら、Fig. 2cに示すように、129バックグラウンドは、LIFシグナル入力が多能性を維持するように強いる強い効果を与えることは知られていたが、本研究では、C57BL6とC57BL6×129 F1（C57BL6 / 129または129 / C57BL6のいずれでも）の間に差異は認められなかった。
(英文)
Induced cell aggregates show poor induction of pluripotency-associated markers
To test the induction of pluripotency markers in cell aggregates obtained from ATP-treated liver cells, we assessed the expression of pluripotency-associated genes. Oct3/4 is a well-defined marker of pluripotent stem cells. Using a primer pair to detect Oct3/4 transcript from the Pou5f1 allele, but not pseudo-genes[13], we did not find a detectable level (above 0.1% of the expression level in mouse ES cells, relative to the expression levels of Gapdh) of the transcript by quantitative polymerase chain reaction (Q-PCR) using a total RNA sample prepared from all cells in the culture (Fig. 3a), indicating that extremely few or no cells expressing Oct3/4 were present. Interestingly, expression of Gfp from the Oct3/4-GFP transgene (GOF18)「14 」was detected in liver cells cultured for seven days irrespective of ATP treatment, suggesting leaky expression of this transgene.
誘発された細胞凝集体は多能性関連マーカーの誘導が低い
ATP処理された肝細胞から得られた細胞凝集体中の多能性マーカーの誘導を確認するために、多分化能関連遺伝子の発現を評価した。 Oct3 / 4は多能性幹細胞の明確なマーカーである。 疑似遺伝子でないPou5f1対立遺伝子からOct3 / 4転写物を検出するプライマーを使ったが、我々は、培養物中の全細胞から調製された総RNAサンプルを用いた定量ポリメラーゼ連鎖反応（Q-PCR）によっても（Gapdhの発現レベルに比して、マウスES細胞の発現レベルの0.1％を超える）検出可能なレベルの転写物を見出さなかった(Fig. 3a)。これは Oct3 / 4を発現する細胞が極めて僅かか全く存在しないことを示している。 興味深いことに、Oct3 / 4-GFPトランスジーン（GOF18）[14]からのGfpの発現は、ATP処理とは無関係に7日間培養した肝細胞で検出され、このトランスジーンの漏出発現を示唆している。
(図注)
Figure 3: Q-PCR analysis for the expression of pluripotency markers in induced cell aggregates.
Figure 3
(a) Q-PCR analysis of the low-pH treated liver cells cultured for 7 days. Liver cells were prepared from 7-day old GOF mice and treated with either ATP or HCl, or without stressor. RNA samples were prepared from all cells in the wells at day 7 of culture and the relative expression levels of Gfp (derived from GOF Tg) and Oct3/4 (derived from the endogenous Pou5f1 allele) to Gapdh were indicated with standard deviation. The expression levels in control ES cells carrying CAG-GFP Tg were set at 1.0. (b) Q-PCR analysis of the single cell aggregates derived from the ATP-treated or non-treated liver cells cultured for seven days. The liver cells were prepared from 4-days old of C57BL6/129 mice and the single cell aggregates were separately treated for quantification of gene expression. The relative expression levels of pluripotency-associated genes to Gnb2l1 were indicated with standard deviation. The expression levels in 10 control ES cells were set at 1.0. (c) Frequency of cell aggregates showing the levels of Oct3/4 expression comparable to ES cells. The relative expression levels of Oct3/4 in single cell aggregates derived from liver cells were measured as b and the frequency of the cell aggregates with the levels of Oct3/4 expression over 0.001 of relative expression to ES cells is indicated.
図3：誘導された細胞凝集体における多能性マーカーの発現のQ-PCR分析。
図3
（a）7日間培養した低pH処理肝細胞のQ-PCR分析。肝細胞を7日齢のGOFマウスから調製し、ATPまたはHClのいずれか、またはストレッサーなしで処理した。培養7日目にウェル中の全細胞からRNA試料を調製し、Gfp（GOF Tg由来）およびOct3 / 4（内因性Pou5f1対立遺伝子由来）のGapdh<訳注:glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase;GAPDH mRNAはさまざまな生理状態において発現量が変わらないと考えられている>に対する相対発現レベルを標準偏差で示した。 CAG-GFP Tgを保有するコントロールES細胞における発現レベルを1.0に設定した。 （b）7日間培養したATP処理または非処理肝細胞に由来する単一細胞凝集体のQ-PCR分析。肝細胞は4日齢のC57BL6 / 129マウスから調製し、遺伝子発現の定量のために単一細胞凝集体を別々に処理した。 Gnb2l1<訳注: guanine nucleotide-binding protein subunit beta-2-like 1 (GNB2L1):なぜ指標として使われるのかの根拠は不明>に対する多能性関連遺伝子の相対発現レベルを標準偏差で示した。 10個のコントロールES細胞における発現レベルを1.0に設定した。 （c）ES細胞に匹敵するOct3 / 4発現レベルを示す細胞凝集塊の頻度。肝細胞由来の個別細胞凝集塊におけるOct3 / 4の相対的発現レベルをbとして測定し、ES細胞に対する相対発現の0.001を超えるOct3 / 4発現のレベルを有する細胞凝集塊の頻度を示す。
(英文)
We next performed qPCR on individual cell aggregates isolated from culture. Aggregates were selected and RNA samples were prepared separately. These RNAs were reverse-transcribed and qPCR was performed. We found that some aggregates expressed a comparable amount—more than 10% of the expression level in ES cells—of pluripotency-associated genes, including Oct3/4. Since the cell aggregates consist of ~10 cells, such expression level indicated possible existence of the cell(s) expressing pluripotency-associated genes at the equivalent level to that in ES cells. Klf4 expression was detected in all samples, which may reflect its expression in liver cells, and thus serves as a positive control in this assay. Of cell aggregates derived from liver cells treated with ATP, 19% expressed the amount of Oct3/4 comparable to ES cells (Fig. 3c). These data suggest that some proportion of cells in the aggregates express pluripotency-associated genes at comparable levels to those of ES cells.
次に培養物から単離された個々の細胞凝集塊についてqPCRを行った。凝集塊を選択し、RNA試料を別々に調製した。これらのRNAを逆転写し、qPCRを行った。我々は、いくつかの凝集塊が、ES細胞の発現レベルの10％以上の、Oct3 / 4を含む多能性関連遺伝子の、比較可能な量を発現することを見出した (Fig. 3b)。細胞凝集塊は10個以上の細胞からなるため、そのような発現レベルは、多能性関連遺伝子を発現する細胞がES細胞と同等のレベルで存在する可能性があることを示した。 Klf4発現は全てのサンプルにおいて検出されたが、それは肝細胞におけるその発現を反映している可能性がある、したがって、この実験において陽性コントロールとして使える。 ATP処理した肝細胞由来細胞凝集塊のうち、19％はES細胞に匹敵するOct3 / 4の量を示した(Fig. 3c)。これらのデータは、凝集塊中のある割合の細胞が多能性関連遺伝子をES細胞のレベルに匹敵するレベルで発現している。ことを示唆している。
(英文)
To examine the proportion of the cells expressing Oct3/4 in the aggregates, we next applied immuno-staining using a specific antibody against Oct3/4 we raised and assessed previously[15]. Cell aggregates derived from low-PH treated liver cells were fixed, stained by anti-Oct3/4 antibody, and observed using confocal microscopy. We stained morula-stage mouse embryos as positive controls. By comparison with these positive controls, we found that some of the cell aggregates contained cells expressing Oct3/4 at comparable levels (Fig. 4a). In the case of cell aggregates derived from liver cells treated by ATP, 20% of cell aggregates contained Oct3/4-positive cells (Fig. 4b), which is consistent to the proportion of cell aggregates expressing the amounts of Oct3/4 comparable to ES cells detected by QPCR (Fig. 3c). In contrast, cell aggregates derived from liver cells treated by HCl included Oct3/4-positive cells at a frequency comparable to that of non-treated cells. The presence of Oct3/4-positive cells in the cell aggregates found only 1 in 14 cases in cultures of non-treated liver cells suggests that such cells are derived from Oct3/4-positive cells present in the liver cell population, that in vitro culture may itself be a source of the stress to the cells, or that the immuno-staining technique may produce some non-specific signal. In cell aggregates derived from ATP-treated liver cells, the Oct3/4-positive cells were typically positioned in the center of the cell aggregates and exhibit large nuclei, and were surrounded by Oct3/4-negative cells with small nuclei at the peripheries of the cell aggregates (Fig. 4c).
凝集塊中のOct3 / 4を発現している細胞の割合を調べるために、我々は以前提起評価したOct3 / 4[15]に対する特異的抗体を用いて免疫染色を行った。低PH処理肝細胞由来の細胞凝集塊を固定し、抗Oct3 / 4抗体で染色し、共焦点顕微鏡法を用いて観察した。我々は陽性コントロールとして桑実胚段階のマウス胚を染色した。これらの陽性コントロールと比較すると、細胞凝集塊のいくつかはOct3 / 4を同等のレベルで発現する細胞を含むことがわかった(Fig. 4a)。 ATPで処理された肝臓細胞由来の細胞凝集塊の場合、20％の細胞凝集塊がOct3 / 4陽性細胞を含有していたが (Fig. 4b)、これはQPCRによって検出されたES細胞と比較可能なOct3 / 4の量を発現する細胞凝集塊の割合と一致する(Fig. 3c)。対して塩酸で処理した肝臓細胞に由来する細胞凝集塊は、非処理細胞の頻度に匹敵する頻度でOct3 / 4陽性細胞を含んでいた。非処理肝細胞の培養中の14例中1例のみOct3 / 4陽性細胞が存在していたことは、そのような細胞が、肝臓細胞集団に存在していたOct3 / 4陽性細胞に由来するか、試験管内培養自体が細胞へのストレスの原因であり得るか、或いは免疫染色技術が何らかの不特定なシグナルを生み出している可能性がある。 ATP処理肝細胞に由来する細胞凝集塊では、Oct3 / 4陽性細胞は、典型的には、細胞凝集塊の中心に位置し、大きな核を呈し、細胞凝集塊の周辺にある小さい核をもったOct3 / 4陰性細胞に囲まれていた(Fig. 4c)。
(図注)
Figure 4: Immuno-staining of cell aggregates derived from low-pH treated liver cells.
Figure 4
(a) Immunostaining of morula-stage embryos and cell aggregates for Oct3/4 and Nanog. Both samples were treated in parallel and confocal microscopic images were captured with the same exposure time. The embryo is wild-type C57BL6 whereas the cell aggregates were derived from 8-days old of Alb-cre/Rosa-GFP Tg mice. (b) Frequency of cell aggregates carrying Oct3/4-positive cells. The numbers of the immune-stained cell aggregates derived from liver cells and that of carrying Oct3/4-positive cells are indicated for each stressor treatment. (c) Immuno-staining image of cell aggregate for Oct3/4 derived from liver cells prepared from 4-days old C57BL6/129 mice.
図4：低pH処理肝細胞に由来する細胞凝集塊の免疫染色。
図4
（a）Oct3 / 4およびNanogに関する桑実胚段階の胚および細胞凝集塊の免疫染色。 両方の試料を並行して処理し、共焦点顕微鏡画像を同じ曝露時間で捕捉した。 胚は野生型C57BL6であるが、細胞凝集塊はAlb-cre / Rosa-GFP Tgマウスの8日齢に由来する。 （b）Oct3 / 4陽性細胞を保有する細胞凝集体の頻度。 肝臓細胞由来の免疫染色細胞凝集塊およびOct3 / 4陽性細胞を有する免疫染色細胞凝集塊の数は刺激処理ごとに示されている。 （c）4日齢のC57BL6 / 129マウスから調製した肝細胞に由来するOct3 / 4の細胞凝集塊の免疫染色像。
(英文)
Oct3/4-GFP transgene expression not detected in low-pH treated cells
In the original report, the authors used transgenic reporter gene expression as a marker of pluripotency[1]. This reporter consisted of the transcriptional regulatory element of Oct3/4 and the fluorescent marker GFP, designated GOF, which is silent in somatic cells and activated in pluripotent cells[14]. When we used the same transgenic mouse line as a source of dissociated cells, we found that they began to acquire strong auto-fluorescence in culture after ATP treatment. On observation with fluorescent microscopy, most aggregates showed both green and red fluorescence, a sign of auto-fluorescence (Fig. 5a) although this may also include the fluorescent signal from the GOF transgene, since we detected Gfp mRNA by qPCR in these cells after culture in vitro for seven days (Fig. 3a).
低pH処理細胞では検出されなかったOct3 / 4-GFP挿入遺伝子発現
元の報告書で著者らは、多能性のマーカーとしてトランスジェニックレポーター遺伝子発現を用いた[1]。 このレポーターはOct3 / 4の転写調整因子と、蛍光マーカーGFPから構成されていて、GOFと呼ばれ、体細胞ではサイレントであり多能性細胞で活性化される[14]。 我々は、解離細胞の供給源として同じトランスジェニックマウス系統を使用したが、我々はATP処理後の培養皿の中で強い自家蛍光を獲得し始めたことを見出した。 蛍光顕微鏡で観察したところ、ほとんどの凝集塊は緑色蛍光と赤色蛍光の両方を示したが(Fig. 5a)、我々は7日間試験管内培養後のこれらの細胞において、qPCRによりGfp mRNAを検出したので、GOF挿入遺伝子由来の蛍光シグナルも含まれているかもしれない。
(図注)
Figure 5: アnalyses of fluorescent signals from GOF transgene.
Figure 5
(a) Fluorescent microscopic アnalysis of cell aggregates derived from GOF Tg mice. The cell aggregates (top) were derived from liver cells of 6-days old of GOF Tg mice. Fluorescent images with the filter sets for detection of GFP and RFP signals are shown. Images of ES cells carrying CAG-GFP (middle) captured with the same conditions are shown as a control to confirm no leaky signal of GFP in RFP channel. Images of wild-type ES cells (bottom) are shown as a control to confirm spesific signal of GFP in GFP channel. (b) FACS アnalysis of the low-pH treated spleen cells derived from GOF Tg mice. The spleen cells were isolated from 7-day-old GOF Tg mice and prepared with Lympholyte followed by treatment with the indicated stressors. After the culture for seven days, the cells were dissociated, stained with anti-E-cadherin with PE and anti-CD45 with APC, and アnalyzed by FACS. Wild-type ES cells were used as a positive control for E-cadherin staining and a negative control for CD45-staining as well as GFP fluorescence.
図5：GOF挿入遺伝子からの蛍光シグナルの分析。
図5
（a）GOF Tgマウス由来の細胞凝集塊の蛍光顕微鏡分析。細胞凝集塊（上）は、6日齢のGOF Tgマウスの肝細胞に由来。 GFPおよびRFPシグナルの検出のためのフィルターセットを有する蛍光画像が示されている。同一条件下で捕捉されたCAG-GFP（中央）を有するES細胞の画像は、RFPチャネルにおけるGFPの漏出シグナルがないことを確認するためのコントロールとして示されている。野生型ES細胞の画像（下）は、GFPチャネルにおけるGFPの特異的シグナルを確認するためのコントロールとして示される。 （b）GOF Tgマウス由来の低pH処理脾臓細胞のFACS分析。脾臓細胞を7日齢のGOF Tgマウスから単離し、リンパ液で調製し、次いで示された刺激で処理した。 7日間培養した後、細胞を解離させ、PEを有する抗E-カドヘリンおよびAPCを有する抗CD45で染色し、FACSにより分析した。野生型ES細胞をE-カドヘリン染色の陽性コントロールとして使用し、CD45染色およびGFP蛍光の陰性コントルールとして使用した。
(英文)
Specific detection of GFP fluorescence by fluorescence-activated cell sorting (FACS) was also performed. In spleen cells collected using Lympholyte, CD45-positive/E-cadherin-negative blood cells were enriched. The reprogramming of such cells to a state of pluripotency can be monitored by their conversion to CD45-negative/E-cadherin-positive cells and acquisition of GFP expression from the GOF transgene. However, although we again observed increased auto-fluorescence and some reduction of CD45 expression, neither a specific signal of GFP fluorescence nor an increase of E-cadherin expression was observed in the low-pH treated cells (Fig. 5b). Given these findings, we suggest that that there was no evident sign of reprogramming in low-pH treated spleen cells based on the expression of the GOF transgene.
蛍光活性化細胞選別（FACS）によるGFP蛍光の特異的検出も行った。 リンパ液を用いて採取した脾臓細胞では、CD45陽性/ Eカドヘリン陰性の血液細胞が濃縮された。 そのような細胞の多能性状態への再プログラミングは、CD45陰性/ Eカドヘリン陽性細胞へのそれらの変換およびGOF導入遺伝子からのGFP発現の獲得によって検証することができる。 しかし、我々は再び自家蛍光の増加とCD45発現の減少を観察したが、低pH処理細胞においてGFP蛍光の特異的シグナルもE-カドヘリン発現の増加も観察されなかった (Fig. 5b)。 これらの知見を考慮すると、我々は、低pH処理した脾臓細胞において、GOFトランスジーンの発現に基づいての、再プログラミングの明白な徴候がなかったと示唆する。
- 2019/05/09(木) 11:11:17|
- 丹羽検証論文
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