一言居士の独言

(英文)
Induced cell aggregates do not contribute to chimeric embryos after injection into pre-implantation embryos

In the original report, the authors showed that the cell aggregates obtained by the culture of low-pH treated cells contribute to chimeras when the cell aggregates were chosen by their morphologies under the microscopic observation, manually dissected and injected into blastocysts (Fig. 4a of Obokata et al.[1]). The frequency of obtaining chimeric mice from injected blastocysts reached 24% (64 chimeric mice from 264 injected blastocysts; Figure S7b<→Extended Data Figure 7b> of Obokata et al.[1]). We prepared cell aggregates from the liver cells dissociated from the livers of transgenic mice carrying CAG-EGFP[16] or selected cell aggregates expressing GFP prepared from the liver cells derived from Alb-cre: Rosa-GFP double transgenic mice[17],[18] (Fig. 6, top) and repeated injections of these into morula and blastocysts eight times. However, we found no chimeric embryos carrying GFP-positive cells among 117 embryos derived from 244 injected embryos based on observation by fluorescent microscopy (Fig. 6, bottom), although the embryo manipulation technique of the animal facility should be excellent as the huge number of knockout mice were routinely generated by the injection of ES cells into blastosysts (*ttp://www2.clst.riken.jp/arg/mutant_mice_generated_in_CDB.html and ⁑ttp://www2.clst.riken.jp/arg/publications.html). These data strongly suggest that the acquisition of pluripotency occurs in cell aggregates derived from low-pH treated liver cells only extremely rarely, if at all.


誘導された細胞凝集塊は、移植前の胚への注入後にキメラ胚に寄与しない

元の報告では、著者らは、低pH処理細胞の培養によって得られた細胞凝集塊が、顕微鏡観察下で形態によって選択され、手動で解剖され、胚盤胞に注入されると、キメラに寄与することを示した(Fig. 4a of Obokata et al.[1])。注入された胚盤胞からキメラマウスを得る頻度は24％に達した(264個の注入された胚盤胞から64のキメラマウス; Figure S7b<→Extended Data Figure 7b> of Obokata et al.[1])。我々は、CAG-EGFP [16]を持つトランスジェニックマウスの肝細胞から分離した肝細胞からの細胞凝集体を用意し、もしくはAlb-cre：Rosa-GFP二重挿入トランスジェニックマウス[17],[18] 由来肝細胞から用意されたGFP発現細胞凝集体を選択し、これらを桑実胚および胚盤胞へ8回注入を繰り返した。しかしながら我々は、蛍光顕微鏡による観察に基づいて、244個の注入された胚由来の117個の胚の中で、GFP陽性細胞を保持するキメラ胚を一つも見いださなかった（図6、下）。同じ動物施設の胚操作技法がES細胞を胚盤胞に注入することにより、ノックアウトマウスを日常的に見事に作成しているにも関わらずである（*ttp://www2.clst.riken.jp/arg/mutant_mice_generated_in_CDB.htmlおよび*ttp://www2.clst.riken.jp/arg/publications.html）。 これらのデータは、多分化能の獲得が低pH処理肝細胞に由来する細胞凝集体でまったく起きないか、ごくまれにしか起こらないことを強く示唆している。


(図注)
Figure 6: Chimera assay of cell aggregates.
Figure 6

Cell aggregates derived from liver cells prepared from 8-day-old Alb-cre:Rosa-GFP Tg (upper panels) were injected into morula-stage embryos. The manipulated embryos were transferred into the uterus and the embryos were recovered at E10.5. The dissected embryos were observed under fluorescent microscopy for the contribution of GFP-positive cells.


図6：細胞凝集体のキメラ実験。
図6

8日齢のAlb-cre：Rosa-GFP Tg（上部パネル）から調製した肝細胞由来の細胞凝集物を、桑実胚期の胚に注入した。 操作された胚を子宮に移し、胚をE10.5日で回収した。 GFP陽性細胞の寄与について、切開した胚を蛍光顕微鏡下で観察した。


(英文)
Induced cell aggregates do not give rise to stem cell lines

The original reports stated that two different types of stem cell lines could be established from cell aggregates obtained by the culture of low-pH treated cells: ES-like ‘STAP stem cells’ (Fig. 5 of Obokata et al.1) and trophoblast stem (TS)-like ‘FGF-induced (FI) stem cells’ (Fig. 2 of Obokata et al.2). To reevaluate these claims, we transferred cell aggregates derived from liver cells from various genetic backgrounds into the culture conditions for derivation of either ES-like or TS-like stem cells. In the case of the culture for ES-like stem cells in serum-free culture containing knockout serum replacement (KSR), adrenocorticotropic hormone (ACTH) and LIF19, most of the cell aggregates died without outgrowth, which may attributable to the absence of serum, while a small number aggregates gave rise to colonies containing small cells with large nuclei, resembling the morphology of embryonic stem cells. However, most of these cells ceased proliferation at day 7 and gradually regressed. Marked proliferation after day 7 was observed in only three of 492 cell aggregates and none of these gave rise to cell lines (Fig. 7a). In the case of the culture for TS-like stem cells containing FGF-4 and heparin20, many clumps showed outgrowth of fibroblastic cells, which may be due to the presence of FGF2 in the medium. Few of these (22 of 391 cell aggregates) gave rise to colonies of small stem cell-like cells, and one could be passaged three times (Fig. 7b). However, all ultimately regressed without giving rise to cell lines. These data showed that we are unable to derive stem cell lines from aggregates derived from low-pH treated liver cells.


誘導された細胞凝集体は幹細胞株を生じない

元の報告は、低pH処理細胞の培養によって得られた細胞凝集体から2つの異なるタイプの幹細胞株を樹立することができたと述べている。即ちES細胞様STAP幹細胞（Obokata et al.1の図5）および栄養膜（TS）様の「FGF誘導（FI）幹細胞」（Obokataらの図2）である。これらの主張を再評価するために、ES様またはTS様幹細胞の誘導のための培養条件に、様々な遺伝的背景の肝細胞由来の細胞凝集体を移した。ノックアウト血清代替物（KSR）、副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）およびLIF19を含む無血清培養物におけるES様幹細胞の培養の場合、細胞凝集物の大部分は、おそらく血清の不在に起因して増殖することなく死滅した。一方、少数の凝集物は、ES細胞の形態に似た大きな核を有する小さな細胞を含むコロニーを形成した。しかし、これらの細胞のほとんどは、7日目に増殖を停止し、徐々に退行した。 7日後の顕著な増殖は、492個の細胞凝集体のうちのわずか3つで観察され、いずれも細胞株を生じなかった（図7a）。 FGF-4およびヘパリン20を含有するTS様幹細胞の培養の場合、多くの塊が線維芽細胞の増殖を示したが、これは培地中にFGF2が存在するためである可能性がある。これらのうちの少数（391個の細胞集合体のうち22個）が小幹細胞様細胞のコロニーを生じ、3回継代することができた（図7b）。しかしながら、最終的に細胞株を生じさせることなくすべて退行した。これらのデータは、低pH処理肝細胞由来の凝集塊から幹細胞株を得ることができないことを示している。


(図注)
Figure 7: Culture of cell aggregates in vitro.
Figure 7

(a) The outgrowth culture of cell aggregate derived from liver cells. Liver cells were prepared from 7-days old of C57BL6 CAG-GFP Tg, treated with ATP and cultured for six days. Single cell aggregates were isolated and cultured on MEF feeder cells with medium containing KSR, ACTH and LIF adapted to the culture of ES cells. The cells continue<→continued> to grow for 15 days but did not give secondary colony after passage. (b) Outgrowth culture of cell aggregates derived from liver cells. Liver cells were prepared from 4-day-old C57BL6/129 mice, treated with ATP, and cultured for six days. The cell aggregates were isolated and cultured on MEF feeder cells with medium containing FGF4 and heparin adapted to the culture of TS cells. The cells continued to grow for 11 days, but did not give rise to secondary colonies after passage.


図7：試験管内細胞凝集体培養。
図7

（a）肝臓細胞に由来する細胞凝集体の増殖培養。 C57BL6 CAG-GFP Tgの7日齢から肝細胞を調製し、ATPで処理し、6日間培養した。 単一細胞凝集体を単離し、ES細胞の培養に適合したKSR、ACTHおよびLIFを含む培地を用いてMEFフィーダー細胞上で培養した。 細胞は15日間増殖を続けたが、継代後に二次コロニーを形成しなかった。（b）肝細胞由来の細胞凝集体の増殖培養。 4日齢のC57BL6 / 129マウスから肝細胞を調製し、ATPで処理し、6日間培養した。 細胞凝集体を単離し、TS細胞の培養に適合したFGF4およびヘパリンを含む培地を用いてMEFフィーダー細胞上で培養した。 細胞は11日間増殖し続けたが、継代後に二次コロニーを生じなかった。


(英文)
Discussion

In the present study, we investigated the properties of cell aggregates obtained by culture of liver cells transiently treated with low-pH stimulus, which was performed by the group directed by the author. We initially followed the protocol described in the original paper[1] with the detail description in protocol exchange where HCl was applied to achieve low-pH condition. However, we merely obtained the cell aggregates expressing the pluripotency makers as described in this report even when it was combined with the culture in medium containing Fgf2, which was not described in the original protocol but subsequently suggested by the authors. However, when we used ATP instead of HCl, also based on a suggestion by the authors, a few cells in a subset of cell aggregates expressed the pluripotency marker Oct3/4 at levels comparable to those in ES cells that were reproducibly detected by QPCR (Fig. 3c) and immunostaining (Fig. 4b). However, the frequency was very low; 5 × 10 liver cells yielded only ~30 cell aggregates, in which about 20% of the cell aggregates contained 1–2 Oct3/4 positive cells, indicating a frequency per seeded liver cell of 0.0012–0.0024%. Moreover, the pluripotency of such cells was not confirmed by chimera formation assay, and they did not give rise to any stem cell lines. We thus conclude that such cell aggregates do not fulfill the definition for STAP cells proposed in the original studies.


討論

本研究では、我々は、著者が指導したグループによって低pH刺激で一過的に処理した肝細胞の培養により得られた細胞凝集体の性質調査した。我々は当初、低pH条件を達成するために塩酸が適用されたプロトコルイクスチェンジの詳細な記述のある元の論文[1]に記載されたプロトコルに従った。しかしながら、我々は、元のプロトコルには記載されていないが、後に著者らの示唆を受けてFgf2を含む培地で培養した場合ですら、単に多能性マーカーを発現する細胞凝集体を取得しただけであった。しかし、同様に著者らの示唆に基づいて、塩酸の代わりにATPを使用した場合、細胞凝集体の一つのサブセットの中のいくつかの細胞は、再現性良くQPCR（図3c）と免疫染色（図4b）によって検出された、ES細胞レベルに匹敵する、多能性マーカーOct3 / 4を発現した。しかし、その頻度は非常に低く、 5×10の5乗個の肝臓細胞はわずか最大30個の細胞凝集体を産生するのみで、そのうちの約20％の細胞凝集体が1から2 個のOct3 / 4陽性細胞を含むのみで、播種肝細胞あたり0.0012から0.0024％の頻度であった。さらに、このような細胞の多能性はキメラ形成実験によって確認されず、いかなる幹細胞株も生じなかった。したがって、我々はこのような細胞凝集体が元の研究で提示されたSTAP細胞の定義を満たしていないと結論する。


(英文)
Moreover, since the frequency of Oct3/4-positive cells in the cell aggregates was quite low, it was impossible to determine whether they were selected from the original population or induced in culture, again highlighting the lack of evidence supporting the existence of the reported STAP phenomenon. An independent examination was made on chimeric potency of STAP-like cell aggregates that were generated by Haruko Obokata. Among 1154 embryos injected with the aggregates, 671 developed beyond E8.5; however, none of the aggregates made significant contribution to any tissues, the details of which was reported in a Biorixiv website (bioRxiv doi: ⁑ttp://dx.doi.org/10.1101/028472). These data are consistent to the recent report by De Los Angeles et al.[22].


加えて、細胞凝集体中のOct3 / 4陽性細胞の頻度は非常に低かったので、それらが元の集団から選択されたか、培養で誘導されたかを決定することは不可能であり、再度、報告されたSTAP現象の存在を保証する証拠の欠如が注目された。小保方晴子自身によって作製されたSTAP様細胞凝集体のキメラ形成能力について独立した検証がなされた。凝集体を注入された1154胚のうち671がE8.5日を超えて発生した。しかし、どの凝集体もいかなる組織にも有意な寄与をしなかった。その詳細はBiorixivのウェブサイト（bioRxiv doi：*ttp://dx.doi.org/10.1101/028472）で報告されている。これらのデータは、De Los Angelesらによる最近の報告書[22]と一致している。

(英文)
Materials and Methods

Animals

C57BL/6NJcl (CLEA Japan) and 129X1/SvJJmsSlc (Japan SLC) mice were purchased from suppliers. C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)C14-Y01-FM131Osb transgenic mouse (CAG-GFP Tg) line was provided by Research Institute for Microbial Disease, Osaka University[16]. C57BL/6J-Tg(GOFGFP)11Imeg transgenic mouse (GOF-Tg) line was obtained from RIKEN Bio-Resource Center (RBRC00771)[21]. B6.Cg-Tg(Alb-cre)21Mgn/J transgenic mouse (Alb-cre Tg) line was supplied by Jackson Laboratory[18]. R26R-H2B-EGFP transgenic mouse (Rosa-GFP) line was generated by Laboratory for Animal Resources and Genetic Engineering (LARGE), RIKEN CDB[17]. All animal experiments were carried out in accordance with our Guidelines for the Care and Use of Laboratory animals and were approved by the Institutional Committee for Laboratory Animal Experimentation (RIKEN Kobe Institute).



材料と方法

動物

C57BL / 6NJcl（CLEA Japan）および129X1 / SvJJmsSlc（日本SLC）マウスは業者から購入された。 C57BL / 6-Tg（CAG-EGFP）C14-Y01-FM131Osbトランスジェニックマウス（CAG-GFP Tg）系統は、大阪大学微生物病研究所より提供された。 C57BL / 6J-Tg（GOFGFP）11 Imgトランスジェニックマウス（GOF-Tg）系統はRIKEN Bio-Resource Center（RBRC00771）[21]から得た。 B6.Cg-Tg（Alb-cre）21Mgn / Jトランスジェニックマウス（Alb-cre Tg）系統は、Jackson Laboratory[18]により供給された。 R26R-H2B-EGFPトランスジェニックマウス（Rosa-GFP）系統は、理研CDB[17]の動物資源および遺伝工学研究所（LARGE）により作製された。 すべての動物実験は、我々の実験動物のケアおよび使用に関するガイドラインに従って実施され、実験動物実験機関委員会（理研神戸研究所）によって承認された。



(英文)
Isolation of cells from mice

4–9-day-old mice were euthanized using carbon dioxide and then sterilized with 70% ethanol. For the isolation of spleen cells, excised spleen was minced with scissors and the tissue fragments were dissociated in phosphate buffered serine (PBS) by pipetting.The cell suspension was strained through a cell strainer followed by the collection of cells by centrifugation at 1,000 rpm for 5 min. The collected cells were re-suspended in 5 ml of Dulbecco’s Modified Eagle medium (DMEM; Life Technologies) and added to the same volume of Lympholyte® (Cedarlane), and then centrifuged at 1,000 g<→rpm > for 20 min. The lymphocyte layer was isolated and washed with PBS to obtain single cell suspension.For the isolation of liver cells, excised liver was minced with scissors and the tissue fragments were dissociated by incubation in Type I collagenase (Worthington Biochemical) solution (0.5 mg/ml in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS, no calcium, no magnesium; Life Technologies)). Next, the cell suspension was strained through a cell strainer followed by the collection of cells by centrifugation at 1,000 rpm for 5 min. For the isolation of heart cells, the excised heart was minced with scissors and the tissue fragments were dissociated by incubation in Type II collagenase (Worthington Biochemical) solution (0.5 mg/ml in HBSS).The cell suspension was strained through a cell strainer followed by the collection of cells by centrifugation at 1,000 rpm for 5 min.


マウスからの細胞単離

4から9日齢のマウスを二酸化炭素を用いて安楽死させ、次いで70％エタノールで滅菌した。脾臓細胞の単離のために、摘出した脾臓をはさみで細かく刻み、組織断片をピペットでリン酸緩衝セリン（PBS）中で解離させた。細胞懸濁液を細胞濾過器に通し、続いて1,000rpmで5分間遠心分離することによって細胞を回収した。回収した細胞を5mlのダルベッコ改変イーグル培地（DMEM; Life Technologies）に再懸濁し、同量の Lympholyte® (Cedarlane)に加え、次いで1,000rpmで20分間遠心分離した。リンパ球層を単離し、PBSで洗浄して単細胞懸濁液を得た。肝臓細胞の単離のために、切除した肝臓をハサミで細かく刻み、I型コラゲナーゼ（Worthington Biochemical）溶液(0.5 mg/ml in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS, no calcium, no magnesium; Life Technologies))の中で組織断片を保温維持によって単離した。次に、細胞懸濁液を細胞濾過器に通し、続いて1000rpmで5分間の遠心分離によって細胞を回収した。心臓細胞の単離のために、切除した心臓をハサミで細かく刻み、II型コラゲナーゼ（Worthington Biochemical）溶液（HBSS中0.5mg / ml）中での保温維持により組織断片を解離させた。細胞懸濁液を細胞濾過器に通し、続いて1,000rpmで5分間遠心分離することによって細胞を回収した。


(英文)
Low-pH treatment and culture of cell aggregates

Diluted HCl solution was prepared with 10 μl of 35% HCl (Nakarai) in 590 μl HBSS. Diluted ATP solution was prepared with ATP (Sigma) in distilled water at 200 mM. Titration of pH with various amount of diluted HCl or ATP was performed with 500 μl of HBSS containing 7 × 10 liver cells. As a routine method, 10 μl of either diluted HCl or ATP solution was added into 500 μl of cell suspension containing 5 × 10 cells in HBSS followed by incubation for 25 min at 37 °C, and then centrifuged at 1,000 rpm at room temperature for 5 min. After the supernatant was removed, precipitated cells were re-suspended and plated onto either adhesive or non-adhesive plates at cell density of 1–5 × 10 cells per well in 1 ml of the culture medium. The culture medium consists of DMEM/HamF12 (Life Technologies) supplemented with 1,000 U/ml of mouse LIF (home-made) and 2% of B27® Supplement (Life Technologies). Optionally, recombinant human Fgf2 (Wako) was added at final concentration of 10 ng/ml.


低pH処理および細胞凝集体の培養

35％塩酸（Nakarai）10 μlに590μlのHBSSを加えた希釈塩酸溶液を用意した。希釈ATP溶液は蒸留水中にATP（Sigma）を200mM<訳注:ミリモル毎リットル (millimole per litre) >になるように調製した。様々な量の希釈塩酸または希釈ATPによるpH滴定が、500μlのHBSS中の7×10の５乗個の肝細胞に対して実施された。通常の方法として、HBSS中の5×10の５乗個の細胞を含む500μlの細胞懸濁液に10μlの希釈塩酸または希釈ATP溶液を加え、37℃で25分間保温維持した後、室温で1,000rpmで５分間遠心分離した。上清を除去した後、沈降した細胞を再懸濁し、接着性または非接着性プレートのいずれかに、培地1ml中に1ウェル当たり1から5×10の５乗個の細胞密度で播種した。培養培地は、1,000U / mlのマウスLIF（自家製）および2％のB27® Supplement (Life Technologies)を補充したDMEM / HamF12（Life Technologies）で構成されている。必要に応じて、組換えヒトFgf2（Wako）を10ng / mlの最終濃度で添加した。

(英文)
QPCR

To quantify the levels of mRNA transcripts, total RNA was prepared by TRIzol® (Life Technologies). cDNA were synthesized from 1 μg of total RNA using SuperScript® III (Life Technologies), and quantified by real-time PCR using a CFX384 system (BioRad). All samples were tested in triplicate, and the mean relative amounts of each transcript were calculated by normalization to an endogenous control Gapdh.

Each cell aggregate was washed with PBS and transferred in 2 μl of PBS into 8 μl RealTime ready Cell Lysis Buffer (Roche) supplied with NP-40, RNAsin and RNase inhibitor. Then 3 μl of cell lysis solution was mixed with 1.5 μl of DNaseI solution (0.2 U/μl) to degradate genomic DNA followed by addition of 1.5 μl of 8 mM EDTA solution to stop the reaction. For reverse transcription of RNA, 3 μl of pre-mixture of SuperScript® VILO reverse transcriptase (Life Technologies) was added into 6 μl of DNaseI-treated cell lysate and incubated at 42 °C for 1 hour. The reverse-transcribed product was pre-amplified with Plutinum multiplex PCR master mix using pooled primer mixture using the reaction cycle (95 °C for 30 sec; 60 °C for 90 sec; 72 °C for 60 sec) for 14 cycles. The mixture was treated with Exonuclease I to remove the primers for pre-amplification, and quantitative PCR was performed with the primer pairs specific for each gene using Quantitest SYBR Green PCR mix (Qiagen) in BioRad CFX384 Real-Time System (Bio-Rad). All samples were tested in triplicate, and the mean relative amounts of each transcript were calculated by normalization to an endogenous control Gapdh or Gnb2l1.

定量PCR

mRNA転写物のレベルを定量するために、 TRIzol® （Life Technologies）により全RNAを調製した。 SuperScript® III (Life Technologies)を用いて1μgの全RNAからcDNAを合成し、CFX384システム（BioRad）を用いたリアルタイムPCRによって定量した。 全ての試料を三重に試験し、各転写産物の平均相対量を、内在性コントロールGapdhに対する標準化によって計算した。

各細胞凝集体をPBSで洗浄し、NP-40、RNAsinおよびRNase阻害剤を加えた8μlのRealTime ready Cell Lysis Buffer（Roche）の中の2μlのPBS中に移した。次に、3μlの細胞溶解液を1.5μlのDNaseI溶液（0.2U /μl）と混合してゲノムDNAを分解し、1.5μlの8mM EDTA溶液を添加して反応を停止させた。 RNAの逆転写のために、SuperScript® VILO reverse transcriptase (Life Technologies)の予備混合物3μlを6μlのDNaseI処理細胞溶解物に加え、42℃で1時間保温保持した。逆転写された産物を、14サイクルの反応サイクル（95℃で30秒; 60℃で90秒; 72℃で60秒）を使用して、プールされたプライマー混合物を使用してPlutinum multiplex PCR master mixで事前増幅した。 混合物をエキソヌクレアーゼIで処理して予備増幅のためのプライマーを除去し、BioRad CFX384 Real-Time System（Bio-Rad）中でQuantitest SYBR Green PCRミックス（Qiagen）を用いて、各遺伝子に特異的なプライマー対を用いて定量的PCRを行った。全ての試料を三重に試験し、各転写物の平均相対量を、内在性コントロールGapdhまたはGnb21lに対する標準化によって計算した。


(英文)
Immunostaining

Cells were fixed by 4% paraformaldehyde in PBS for 30 min at 4 °C and then permeabilized by 0.1% Triton X-100 in PBS for 15 minutes at room temperature (RT). After brief washing with PBS followed by blocking with PBS containing 2% FCS, the cells were incubated with the following primary antibodies: anti-Oct3/4 rabbit antiserum15 and anti-Nanog rat monoclonal antibody (R&D) for overnight at 4 °C.After washing with PBS, the cells were incubated with Alexa Fluor 488- or 633-conjugated donkey antibodies (Invitrogen) were used in a proper combination of species specificity as indicated in Figure legends.Fluorescent images were captured with an IX51 microscope with DP70 digital camera (Olympus) or a Leica SP8 confocal microscope (Leica).



免疫染色

細胞をPBS中の4％パラホルムアルデヒドで4℃で30分間固定し、次いでPBS中の0.1％Triton X-100により室温（RT）で15分間透過処理した。 　　　PBSで短時間洗浄した後、2％FCSを含むPBSでブロッキングし、以下の一次抗体:抗Oct3 / 4ウサギ抗血清15および抗Nanogラットモノクローナル抗体（R＆D）、とともに一晩保温維持した。PBSで洗浄した後、細胞をAlexa Fluor 488または633結合ロバ抗体（Invitrogen）とともに保温維持した。両者は図の注に示すように種特異性の適切な組み合わせで使用した。 蛍光画像を、DP70デジタルカメラ（Olympus）を備えたIX51顕微鏡またはLeica SP8共焦点顕微鏡（Leica）で捕捉した。


(英文)
FACS<=fluorescence-activated cell sorting>

For flow cytometric analyses, cell aggregates were harvested, washed by PBS, and incubated with TrypLETM Select (Life Technologies) for 5 min. After dilution with culture medium, aggregates were dissociated into single cells by gentle pipetting. Cells adhered to the culture substrate were also harvested following a standard method. These cells were mixed and collected as pellets by a centrifugation. For quantification of GFP-positive population, dissociated cells were re-suspended in 500 μl HBSS containing 1 μl of DRAQ7, a cell-nonpermeable DNA dye (for the detection of dead cells; Cell Signaling). When combined with a staining for CD45 antigen, cell pellets were suspended with 50 μl HBSS containing 10 μl of APC-conjugated rat anti-CD45 antibody (BD Pharmingen), and incubated for 30 min on ice. For co-staining with CD45/E-cadherin antibodies, cell pellets were suspended in culture medium, and then incubated for 30 min in CO2 incubator. The cells were harvested and suspended with 50 μl HBSS containing 5 μl biotin-labeled rat anti-E-cadherin antibody (ECCD2). After incubation for 30 min on ice, the stained cells were once washed by HBSS, re-suspended with 50 μl HBSS containing 1 μl PE-conjugated streptavidin (Life Technologies) and 10 μl APC-conjugated anti-CD45 antibody, and further incubated for 30 min on ice. These stained cells were once washed by HBSS and suspended with 500 μl HBSS.

After the cell suspension was passed through a filter mesh, the cells were analyzed using a FACSAria IIIu cell sorter (Becton Dickinson).

FACS<蛍光活性化セルソーター>

フローサイトメトリー分析のために、細胞凝集体を採取し、PBSで洗浄し、TrypLETM Select（Life Technologies）と共に5分間保温維持した。培地で希釈した後、穏やかなピペッティングにより凝集物を単細胞に解離させた。培養基質に付着した細胞も標準的な方法に従って採取した。これらの細胞を混合し、遠心分離によりペレットとして回収した。GFP陽性集団の定量のために、解離した細胞を1μlのDRAQ7、細胞不透過性DNA色素（死細胞の検出のために、Cell Signaling）を含む500μlのHBSSに再懸濁した。CD45抗原染色との組み合わせの場合、細胞ペレットを10μlのAPC結合ラット抗CD45抗体（BD Pharmingen）を含有する50μlのHBSSで懸濁し、氷上で30分間保温維持した。CD45 / E-カドヘリン抗体による共染色の場合は、細胞ペレットを培地に懸濁し、次いで二酸化炭素保温機中で30分間保温維持した。細胞を採取し、5μlのビオチン標識ラット抗E-カドヘリン抗体（ECCD2）を含有する50μlのHBSSで懸濁した。氷上で30分間保温維持した後、染色した細胞をHBSSで1回洗浄し、1μlのPE結合ストレプトアビジン（Life Technologies）および10μlのAPC結合抗CD45抗体を含有する50μlのHBSSで再懸濁し、さらに氷上で30分保温維持した。これらの染色された細胞をHBSSでもう一度洗浄し、500μlのHBSSで懸濁した。

細胞懸濁液をフィルターメッシュに通した後、FACSAria IIIu細胞ソーター（Becton Dickinson）を用いて細胞を分析した。


(英文)
Injection into pre-implantation embryos

Cell aggregates obtained by the ATP treatment of liver cells were cut into smaller pieces using a laser (XYClone, Nikko Hansen & Co., Ltd) or shaped glass capillaries, and single piece was then microinjected into each 8-cell or blastocyst stage embryo from ICR mice (Charles River Laboratories Japan, Inc.). Injected embryos were transferred to the uterus of 2.5 dpc pseudopregnant ICR females (Charles River Laboratories Japan, Inc.) on or the next day of injection.


着床前胚への注射

肝細胞のATP処理により得られた細胞凝集体を、レーザー（XYClone、Nikko Hansen＆Co.、Ltd）または成形ガラス毛細管を用いてより小さい断片に切断し、次いで単片をそれぞれICRマウス（Charles River Laboratories Japan、Inc.)の8細胞期胚または胚盤胞期胚に注射注入した。 挿入胚は移植当日もしくは翌日、交尾後<訳注:不妊オスを使う>2.5日のメスの偽妊娠ICRマウス(Charles River Laboratories Japan、Inc.）の子宮に移入された。


(英文)
Culture for derivation of stem cells

The culture medium for derivation of ES-like stem cells consists of Glasgow-modified eagles medium (GMEM, Sigma), 15% KnockOut Serum Replacement® (KSR, Life Technologies), 1 × non-essential amino acids (NEAA, Nakarai), 1 × Sodium Pyruvate (Nakarai), 10－4 M 2-mercaptoethanol (Nakarai), 1,000 U/ml of LIF and 10 μM ACTH (Kurabo on consignment). We confirmed the medium is optimal for the culture of conventional ES cells. The culture medium for derivation of TS-like stem cells consists of GMEM, 20% FCS, 1 × NEAA, 1 × Sodium Pyruvate, 10－4 M 2-mercaptoethanol, 25 ng/ml of recombinant mouse Fgf4 (Wako) and 1 μg/ml of heparin (Wako).We confirmed the medium is optimal for the culture of conventional TS cells. To derive stem cells, cell aggregates were isolated under a microscope and transferred into a well of 96-well plate with 100 μl of the culture medium and 1,000 feeder cells. Feeder cells were prepared by treatment of mouse embryonic fibroblasts prepared from day 14 C57BL6 embryos with Mitomycin C (Wako) for 3 hours.



幹細胞誘導培養

ES様幹細胞の誘導のための培地は、グラスゴー改変イーグル培地（GMEM、Sigma）、15％KnockOut血清代替物®（KSR、Life Technologies）、1×非必須アミノ酸（NEAA、Nakarai） 1×ピルビン酸ナトリウム（Nakarai）、10-4M 2-メルカプトエタノール（Nakarai）、1,000U / ml LIFおよび10μMACTH（クラボウは委託）で構成されている。我々は、培地が従来のES細胞の培養に最適であることを確認した。TS様幹細胞の誘導のための培養培地は、GMEM、20％FCS、1×NEAA、1×ピルビン酸ナトリウム、10 -4 M 2-メルカプトエタノール、25ng / mlの組換えマウスFgf4（Wako）および1μg / mlのヘパリン（Wako）で構成されている。我々は、培地が従来のTS細胞の培養に最適であることを確認した。幹細胞を誘導するために、細胞凝集体を顕微鏡下で単離し、100μlの培養培地および1,000個のフィーダー細胞を有する96ウェルプレートのウェルに移した。フィーダー細胞は、14日目のC57BL6胚から得られ、マイトマイシンC（Wako）で3時間調整されたマウス胚線維芽細胞の処理によって準備された。

1. 2019/05/09(木) 11:21:46|
2. 丹羽検証論文
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