一言居士の独言

[連投1]
この場を借りてガンバレの楠本さんへの連絡をさせてください。
>>
学さんのブログで漏れ出し現象について言及しておられますが、OCT4-GFPが強く発現している画像とそうでない画像があると思うのですが、どう思われますか。

GFPの漏れ出しは丹羽さんの発見で、Oct4-GFP人工遺伝子が発現して、GFPという蛍光蛋白質が製造されて、紫外線を当てると緑色蛍光しているにも関わらず、肝心なOct4遺伝子そのものが発現してないという現象で、こちらはPCRで遺伝子の発現を確認し、発現していてもOct4蛋白が製造されているか否かは免疫染色で確認しますが、まずPCRでOct4遺伝子のmRNAが発現していないと言ってるんです。

[連投2]
漏れ出しの発見はそれ自体が一つの科学的発見で、だれかが興味を持ったら調べるでしょうから、丹羽さんはInterestingly と書いているんでしょうね。この調査を通して大発見が無いとも限りません。
どんな遺伝子も先頭にプロモーター配列がくっついていて、このプロモーターが体内の特定の蛋白質の増減に反応して本体の遺伝子が発現したりしなかったりする仕組みになっています。

[連投3]
Oct4蛋白質を製造する設計図であるOct4遺伝子にもそれを稼働させるプロモーター配列があります。対してGFP遺伝子はご承知の如くオワンクラゲが蛍光蛋白質を製造する仕組みを利用して目的の遺伝子の発現と対応させて光らせる人工遺伝子で、Oct4遺伝子がターゲットなら人工遺伝子をOct4遺伝子のプロモーター部位につなげたものをヴィルスベクターを使って核内の染色体に感染挿入させる。これで、内在性Oct4遺伝子が発現するときには、同時にGFP遺伝子も発現するという仕組みができる(人工遺伝子に対して内在性遺伝子と呼び分けている)。これがGOFマウスと呼ばれているものだと理解しています。

[連投4]
若山研ではこのマウスを使ってES細胞の研究をしていましたので、必要があって自家繁殖させていました。PCRでの発現確認はとても面倒なものなので、小保方さんはOct4の発現をリアルタイムで確認できるGOFマウスでやってみたかったという動機と震災の偶然が重なって、若山さんのところでこのGOFマウスを使っての酸浴実験を始めたら、たくさん光るようになったわけです。無論、若山さんも小保方さんもGFPの漏れ出しなんて、この時には知らないんです。

[連投5]
三胚様分化する細胞であるということに加えて事件のもう一つの原因になったのがこのGFPの漏れ出しというアーティファクトだったわけです。自家蛍光を識別できないなんて児戯です。博士さんたちですよ。蛍光顕微鏡の見方なんて一般教養レベルではないのですかね。この未知のアーティファクトがなかったら若山さんはこの細胞をntES化しようとは思わなかったでしょうね。博論の実験ですでに小保方さんのスフィア塊からはまともなキメラはできないと分かっていました。

[連投6]
小保方さんの三胚様分化実験でも20個に1個、50個に1個の成功率で、しかもティシュー論文では一個のスフィア塊の構成細胞が2000個以上とされている中のどの細胞が分化したのかすらわからないのですから、そのままでもう一度やろうとは思いませんね。フロリダ会議で"できてきている"のではないかと方向転換した実験の中で多数GFP蛍光が出た。この組み合わせで、若山さんはスタンダードなやり方ではキメラができないと結論された後に、ntES化を試そうという気になったのだと推測しています。このGFP確認された細胞ならクローン胚に入れられる。

[連投7]
若山さんは既に最初のGOFの実験時に同時並行でGOFのntES化を初めていると思います。最初からF1でやることはないでしょうね。ただ沢山光っているから、形態判断でF1も次にやってみて、小保方さんに最初に成功だと見せた胎児はCAG入りだということはレター論文のExtended Data Figure1-aを見ればわかる。しかもPCのプロパティに2011/11/28の4Nキメラとあって、加えて桂報告書によれば「129/Sv×B6GFP」が正しい書き方だと言ってるんですからGFPがヘテロに入っていると言ってることになる。
>>
なお、図の説明にある「B6GFP×129/Sv」 は、最初にメス、その後でオスの遺伝的背景を書く通常の表記法では「129/Sv×B6GFP」 が正しいが、不注意による間違いと思われる。(21P)

[連投8]
このCAGはAcr-CAGだというのはそのあとの12/27テラトーマからアクロシンが出ていることで分かります。これは小保方さんが渡米しているときに若山さんが上から注射したんで、小保方さんはGOFマウスのSTAP細胞を使っていますから、捏造するなら学生のGOF-ESを使うに決まっています。小保方さんは捏造なんてしませんし、無論若山さんはなおさらです。若山さんは当時内示はされていたが、まだ山梨大に行くということが人事秘で誰にも言えなかったので、小保方さんに助手の条件を提示できないままアメリカに帰られそうになるのを止めるために一時的に"できた"と言っただけなんですよ。

[連投9]
ご質問の主旨はExtended Data Figure4-dですよね。dimからはできない。FACS選別したOct4-GFP+細胞からは3/20できた。目視でよく光ってる塊のまま入れたら8/20できたというものですね。
無論、このテラトーマ作成はヴァカンティ足場を使ったものだから、ほとんど三胚様分化実験をシャーレごと皮下に埋めたようなテラトーマで、ES細胞のスタンダードなプロトコルによるテラトーマとは違います。ティシュー論文と博論でもヴァカンティ足場を使ってます。理研でも12/27テラトーマは実験ノートにもそう書かれている。問題はNOD/SCIDが理研でも使われているのかどうかですが、少なくとも12/27テラトーマはヌードマウスですね。ティシュー論文と博論では明確にNOD/SCIDです。

[連投10]
問題は12/27テラトーマ以外はどうだったのかということですが、情報がありません。ここは査読者の質問もあってなぜNOD/SCIDなのかと問われていてアーティクルのマテメソにも炎症を防ぐためと書き込んでます。12/27テラトーマは最初使っていませんから、他の実験事実がそうだったのか、今までの実験のすべてを纏めるときにNOD/SCIDで代表させたのか、小保方さんの意識の中でどういう区別になっているのかはわかりません。以上です。

>>あのねさん
「あの日」66pは博論の話です。63Pから読み直してください。後に持ち去られたとおっしゃっているのは別件との混同です。それとFLSの命名者は若山さんで、Lはリンパ球のことです。はや飲み込みしないで注意深くお願います。

1. 2019/06/01(土) 07:26:42|
2. 学さんブログ検討記録
4. | コメント:0