2ntブログ

一言居士の独言

胎盤に関する考察14

さてさて、いよいよ査読流出の件以来我々の理解ではスピン屋さんであるはずの吉村教授のコメント理解へのチャレンジですね。登場人物たちはいったい何時になったら完全理解に達するのか。見ものです。
  1. 2019/06/04(火) 22:20:21|
  2. STAP事件
  3. | コメント:20

胎盤に関する考察13

思いがけず重大局面にきてしまいましたね。TCRで決着がつくとは思ってなかった。ゲル写真が2Nキメラのものでなかったらこれは小保方さん、もしくはそれを手伝った人の捏造だということになってしまいます。2Nキメラだとしたら若山さんが犯人だと決定です。T細胞でキメラが作られている。若山さんは太田ESを渡されたと主張している。T細胞の由来のキメラがあるというだけで若山さんの主張は破綻します。

あの特許と石井調査時の二つのゲル図にあるキメラマウスの体細胞のTCR結果は桂報告書にとっては捏造でなければ困る。
登場したのは吉村さんでした。彼のコメントを貼っておきましょう。ただし、これは論文のSTAP細胞のTCR結果に対するもので、特許と石川調査のゲルに関して言ってるのではないが、原理に関して語っているところは後者にも通じることですね。

"吉村 より:
2014年3月21日 00:57
たまたまこちらの議論を見かけました。この状況でもSTAPとTCRについて科学的な議論をされているので大変感激しました。多くの疑問は""最後にもう一度TCR” http://new.immunoreg.jp/modules/pico_boyaki/index.php?content_id=350 をお読みいただければご理解いただけるのではないかと思います。発生学者はCD45陽性の分化した細胞からでもOct4陽性の細胞ができたのだから『未分化細胞からでも万能細胞が出来た』と割と気楽にポジテイブに結論ずけようとします。つまりよい面を評価して伸ばそうという姿勢でそれはそれで評価できます。しかし論理性の強い免疫学者は『仮説以外のあらゆる可能性を排除しなければ仮説は正しいと認めない』という堅苦しい人が多いのです。もしSTAP幹細胞やキメラでTCR再構成がひとつでもあればそれはもう逆らえない証明なので『未分化T細胞から万能細胞が出来た』と肯定せざるを得ません。しかし今回のようにSTAP細胞と呼んでいる細胞のかたまりにしかTCR再構成が見つからない場合(幹細胞やキメラには見られない)、現在の知識で一番合理的に説明可能な『ESの混入』あるいは『未同定の組織幹細胞』の可能性を排除しない理由は考えられません。それらの混入の可能性を実験的に排除するためにTCRを持ち出したのに結局それに答えていないのでさらに疑惑が深まるという構図になっています。CD45陽性分画からスタートしたのだから組織幹細胞は入らないというのは幻想で、FACSの純度は不明ですし、未知の幹細胞はCD45陽性かもしれません。
"
"もとさんの『一つの細胞から分化した細胞ならTCR再構成で見えるバンドは1つ(または2つ?)のはずなので、こんなにいっぱいバンドが見えるのが何故かは私にはさっぱり判りません。』は完全に正しい推論です。胚盤胞に入れられる細胞はせいぜい20個でそのうちマウス組織になるのは数個なので、この方法で見れるバンドはせいぜい1本です。この2Nキメラの解析結果が不自然であることを理研の先生たちは理解しているからこの図をもって『キメラにTCR再構成がある』と言わないのだろうと思います。
こんな形而上学的な議論は実はたいした意味がなく、純化したT細胞から作ったSTAP細胞でキメラを作製するとか、4Nキメラで解析するとか、キメラの子孫でTCRの解析をするとか、不確実性を可能な限り排除した感度の高い方法で実験すれば何の問題もないはずです。現在丹羽先生が再現実験をされているそうなので次回ぜひこのような疑問点を解消していただければと思います。
ただ今回の議論で免疫学者は『もっぱらアラさがしをしてポジティブな面を評価しようとしない』傾向があることに自分でも気がつきました。厳密な論理性を要求する学問であるからか、免疫はなかなかとっつきにくく若い人に敬遠される理由がはからずもわかったような気がします。
なおTCRが単一の4Nキメラマウスでは免疫不全になるかもしれませんが、通常の動物実験室の環境でしたら生存できます。TCRトランスジェニックマウスと似たようなものです。"

吉村 より:
2014年3月22日 20:48
とも様
私も粗忽者で間違いが多く、とてもとても尊敬されるような立派な学者ではありません。仲間にはザルと言われています。ただ一応免疫学の専門家ですので学生や一般のかたに興味を持っていただけるチャンスと考えて解説をしているだけです。
ともさんの疑問についてですが、VDJ組み換えではDJが先行して起こりますので両方の染色体でDJ組み換えが起きます。
次にVDの組み換えが起きますが、対立遺伝子排除の機構は主にこの時期に働きます。つまりまずD1J1, D1J2, D2J2の組み換えのいずれか、あるいはD1J1とD2J2の両方の組み換えが両アレルで先に起こって、それからどちらかのアレルのVがDJとくっつく。ここで機能的なTCRβができればもう片方のVD組み替えは起こりません。これが対立遺伝子排除といわれる現象です。もし機能的なTCRβが出来なかった場合はもう片方の染色体でVDの組み換えが起きます。
ですので理論的な組み合わせは相当数ありますが、実験的にはD2J2のプライマーで検出されるGLをもつT細胞は10%程度ではないかと言われています。もし1個のT細胞がマウスになったとすると、可能性としてはGLもしくは組み換えの1本のみ、GLと組み換えの2本、組み換えの2本、あるいは全く検出できない、となります。よってバンドが見えるとすれば1つか2つでともさんの考えは正しいと思います。それぞれの可能性の確率がどれくらいなのかは原著をあたらないとちょっとわからないのですが、明らかにこの方法ではTCR再構成が起こっても全く検出できない不確実性がついてまわります。もしTCR再構成をT細胞由来の染色体のマーカーとして使うのであれば、さらに確実な方法で確認したほうがよいと思います。例えば汎用型のVDJでのPCRプライマーで検出する方法、サザンブロッテイングを行う方法、あるいはwholeゲノムシークエンスシングを行う方法、TCRβレパトア特異的抗体によってFACSで解析する方法などいくつか考えられます。いづれにしましても出発細胞を純化したT細胞やB細胞にすることでCD45+よりも検出感度が格段に上がるはずですのでぜひ再試験ではそうしていただければより確実だと思います。
  1. 2019/06/04(火) 13:48:39|
  2. STAP事件
  3. | コメント:36

学さんブログでの検討記録35

[内緒モード1]
>>学さん
>T細胞並みのTCRが出た特許図20があることが大事なのです。そこだけの理解でも、十分、次の考察に進めると思いますけど。

このコメントはアップしないでください。ご自分が特許図の実験結果から演繹論証した命題にお気づきでないんですか? そんな筈はないと思いますけど。(T細胞並みのTCRが出た)ことがまず第一に重要なのではありませんよね。あなたが実証実験結果から演繹論証したのは(T細胞由来キメラが作られていて、太田受精卵ESも、学生のGOF由来ntESも、「僕のマウス」ESもここでは使われていない。それらのESはいずれも血液ですらない細胞由来だ。T細胞由来キメラは若山さんが作った。)という命題ですね。桂報告書の結論は否定されている。論文通りのキメラであったかどうかはまた別問題ですね。

[内緒モード2]
我々は搦め手側からすでにしたらば考察で桂報告書の結論否定の間接証明は終えてるんです。でも、これほど直接的な証明は気づいていなかった。これはあなたが気づいたんだ。そして気づいた結果、仮にあなたの論文通りのキメラがあるという仮説が僕の仮説によって否定されたとすると、そのとき若山さんはどうなるのだろうと思わず逡巡したから、内緒モードなどとおっしゃり始めたんじゃないのですか。僕がなぜしたらば書き込みを便所の落書きだとこだわってるのかの真の理由に気づかれましたか。馬鹿なマスゴミは今度は若山さんを殺してしまうでしょう。

[内緒モード3]
僕のブログはここです。*ttps://kyobera.blog.2nt.com/
引っ越し作業中ですからカテゴリの連絡掲示板以外には書き込まないでください。無論他の人には他言無用です。ここを知っているのはジムさんと僕の友人一人だけですが普段は彼らはここを見ていません。あなたの指定HNは"清少納言"です。僕があなたに返事するときのHNは"小野小町"です。ここを公開するときにはやり取りは消します。以上です。



彼女からの応答はなく以後も私のコメントをアップしないまま私の質問や意見に関して一方的に語り続けているのでコメント投稿をやめている。
  1. 2019/06/03(月) 19:35:29|
  2. 学さんブログ検討記録
  3. | コメント:0

学さんブログでの検討記録34

[学さんへの質問1]
>>学さん
UP有難うございます。Lさんが答えてくれるか否かは彼の意志ですから先生は関与なさらない方がよいのではないですか。
胸腺から脾臓に入る過程でT細胞の受容体変化がどういう時系列で起きるのかは私は知りません。ただ、Extended Data Figure 2-eに小保方さんが示しているリコンビネーションの概念図があって、これはご教授いただいているVDJ再編成後の長さですね。これがGLの長さでしょ。二つのプライマーもマテメソに示されています。続いて相同染色体の片方にα鎖のVJ再編が起きる。二つのプライマーもマテメソに示されています。原則として対立アレルのGLは必ず残りますね。

[学さんへの質問2]
この件に関して吉村氏は以下のように説明しています。
>>
ともさんの疑問についてですが、VDJ組み換えではDJが先行して起こりますので両方の染色体でDJ組み換えが起きます。
次にVDの組み換えが起きますが、対立遺伝子排除の機構は主にこの時期に働きます。つまりまずD1J1, D1J2, D2J2の組み換えのいずれか、あるいはD1J1とD2J2の両方の組み換えが両アレルで先に起こって、それからどちらかのアレルのVがDJとくっつく。ここで機能的なTCRβができればもう片方のVD組み替えは起こりません。これが対立遺伝子排除といわれる現象です。もし機能的なTCRβが出来なかった場合はもう片方の染色体でVDの組み換えが起きます。

[学さんへの質問3]
ここまでの理解だと(GL0本)のケースは原理的にありませんね。でも、現にPCR結果に実例が2つもあり、原理的にもあると吉村さんがおっしゃっているわけですから私の理解が間違ってるのは明確ではないですか。これが重要でなくてなんでしょう。教えていただきたいんですけどね。以上です。



[プライマーの選択間違い?1]
>>学さん
>D2J2のプライマーで検出される部分は、TCR遺伝子DNAの一部です。ここを理解できれば、全貌が見えます。

ということはGLの検出に使われている(Dβ2: 5′-GCACCTGTGGGGAAGAAACT-3′ and Jβ2.6: 5′-TGAGAGCTGTCTCCTACTATCGATT-3′)がそもそもの実験目的にあってないということではありませんか。そんなことあからさまに言ってる専門家今までいませんでしたよね。笹井さんはこれでいいとしたんでしょ。遠慮があるのですかね。

[プライマーの選択間違い?2]
この理解だとPCRの原理から考えてD2J2自体がリコンビネーションで切り取られて存在してないということになりますね。90%は切り取られていると。どうして今までそれを問題にしなかったんですか。

[プライマーの選択間違い?3]
忘れないでいただきたいが、この細胞はESだと言われてましたよね。ES細胞はリコンビネーションなんて起こしませんね。以上です。


[γδTCRだってあるよ?1]
吉村さんは一個の細胞で0本とおっしゃった。そのときに0本はあるという原理はわかりました。90%という場合は複数個入っているケースて゛、現実のキメラ実験のケースですね。すべての尾部体細胞が1個のT細胞ドナーでできていた時の話と違う。でも吉村さんはわざと話を混同させていますね。
>>
胚盤胞に入れられる細胞はせいぜい20個でそのうちマウス組織になるのは数個なので、

ESの場合は全部ですよね。STAPの場合はどうして数個と決めつけているのでしょうかね。無論私の説の場合はゼロですけどもね。キメラは出来てない。

[γδTCRだってあるよ?2]
特許図は受精卵ESではないですね。この場合はGLのみに現れる。キメラ尾部の場合はGLのないのはαβTCR型でないT細胞、もしくはD2J2の切り取られたαβTCR型のT 細胞なんですね(こんなことがあり得るのか否かはまだお返事を頂いていませんが)。
でもラダーは1本と言わず別にありますから、血液が入ったか、数十個のドナー細胞が尾部に入ったということになるが、後者は胚様の分化順序からして考えにくいですね。だから血液でいいんじゃないですか。
私の仮説では小保方細胞核使用ntESキメラに血液が入ったという実験結果という解釈になる。
学先生ご説のようにこれは受精卵ESでは絶対にない実験試料ですね。

[γδTCRだってあるよ?3]
西川さんは何を教えたのでしょうかね。或いは笹井さんはこのことに気づかなかったのか。また吉村さんはES細胞ではあり得ないとどうしていわないのでしょうかね。以上です。


> 一言居士さん

>D2J2自体がりコンビネーションで切り取られて存在してないということになりますね。

D2J2遺伝子を選ばなかったT細胞があります。各D、Jの遺伝子の中からD2J2領域が選ばれたT細胞で、D2J2プライマーが有効です。

全貌を理解したいなら、ここでのコメント合戦で理解するのは難しいです。図を見ながら周辺の勉強をしてください。吉村氏の説明を何度も読んでください。

こうした交錯した議論は、ため息グループが喜びますからこれ以上は止めましょう。
2019/6/2(日) 午前 9:52
返信する

[これ以上1]
>>学さん
>こうした交錯した議論は、ため息グループが喜びますからこれ以上は止めましょう。

どうでもいいことをおっしゃる。
γδTCR型のT細胞の存在があるから、吉村さんの説明のケースでGLの0本があり得るんですね。そう説明されたらわかりますよ。それとαβTCR型のT 細胞であった場合、GLは対立アレル側の分が必ず出ますね。それからD2J2部分が切り取られて無くなるようなαβTCR型のリコンビネーションはないということでいいですね。1個のT細胞がキメラになった場合、吉村氏の言うように、
①γδTCR型のT細胞ではB鎖ができないからGLラインは出ない。
②αβTCR型のT 細胞ではリコンビネーションが起きていない細胞ではGLだけが1本出る。
③αβTCR型のT 細胞でリコンビネーションが起きている場合はGLと再構成された長さのPCR産物の1本で計2本出る。
ということでいいですね。

[これ以上2]
やっと次に進めます。
今、特許図に絞っていますが、このキメラ尾部細胞は受精卵ES細胞でもなく、リンパ球を使ってないntESによる捏造キメラでもない。
ここはあなたの証明でしたね。異論はありませんよね。そして、吉村氏とLさんはそのことに気づいていないのですね。

[これ以上3]
この後でやっと本物だったか、ntESであったかの話に入れますね。でも以上確認いただきたい。以上です。

  1. 2019/06/02(日) 10:41:27|
  2. 学さんブログ検討記録
  3. | コメント:0

学さんブログでの検討記録33

>>学さん
>とどいてませんか?

小保方さん、挟む場所間違えたと? Vで挟まないといけないの? 泥縄努力過程でもちと気になってたことではあるんですけど。ちょっと考えてみます。
お礼に、英文特許、[00429]に4Nの尻尾がある。以上です。ちと休みます。


>>学さん
>2019/5/31(金) 午後 5:15の学とみ子からの数コメント、読めたかどうかのお返事だけください。

<2019/5/31(金) 午後 5:15の学とみ子からの数コメント>は届いていません。以上です。


[0本1]
>>学さん
頂いた情報で、吉村さんの説明は以下でした。私がお聞きしているのは"理論的"に 0本になるケース(GLすらないケース)がどういう場合なのかということです。90%は何ですかと問うています。端的にご教授願いたいです。
>>
理論的な組み合わせは相当数ありますが、実験的にはD2J2のプライマーで検出されるGLをもつT細胞は10%程度ではないかと言われています。もし1個のT細胞がマウスになったとすると、可能性としてはGLもしくは組み換えの1本のみ、GLと組み換えの2本、組み換えの2本、あるいは全く検出できない、となります。

[0本2]
今の私の理解では理論的にGLが無いケースはありえませんが、現に二つも事例があるのですし、吉村さんは90%もあるとおっしゃってるのですから、私の理解が間違ってるに決まっています。私の理解は以下の通り既述していますよね。こんな大事なところで理解が間違っていては先に進めません、ご教授いただきたい。以上です。
>>
0本になる場合というのは検体細胞のDNA混合液の中に(Dβ2: 5′-GCACCTGTGGGGAAGAAACT-3′ and Jβ2.6: 5′-TGAGAGCTGTCTCCTACTATCGATT-3′)で挟まれている配列が存在し無いないことを意味するので、こんなことは普通ありません。


>>学さん
>今朝のLコメント見てください。とても重要なコメントいただきました。

そこに同じ質問をしましたので是非アップしてください。お願いします。これが分からないと重要か間違ってるかすら判断できません。以上です。


[質問1]
>>Lさん
学さんから頂いた情報で、吉村さんのコメントは以下でしたが、"理論的"に 0本になるケース(GLすらないケース)がどういう場合なのか。90%は何であるかについてご教授願えませんか。
>>
*ttps://blog.miraikan.jst.go.jp/topics/20140317stap-2.html
理論的な組み合わせは相当数ありますが、実験的にはD2J2のプライマーで検出されるGLをもつT細胞は10%程度ではないかと言われています。もし1個のT細胞がマウスになったとすると、可能性としてはGLもしくは組み換えの1本のみ、GLと組み換えの2本、組み換えの2本、あるいは全く検出できない、となります。

[質問2]
今の私の理解では理論的にGLが無いケースはありえませんが、現に二つも事例があるのですし、吉村さんは90%もあるとおっしゃってるのですから、私の理解が間違ってるに決まっています。私の理解は以下の通り既述しています。こんな大事なところで理解が間違っていては先に進めませんので困っています。ご教授いただけませんか。以上です。
>>
0本になる場合というのは検体細胞のDNA混合液の中に(Dβ2: 5′-GCACCTGTGGGGAAGAAACT-3′ and Jβ2.6: 5′-TGAGAGCTGTCTCCTACTATCGATT-3′)で挟まれている配列が存在し無いないことを意味するので、こんなことは普通ありません。






  1. 2019/06/02(日) 08:14:57|
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