一言居士の独言

[連絡1]
>>学さん
一日の連投量に制約があります。お返事は遅れます。ご了解願う。JAKiに関するネイチャー第二レフェリーの査読文だけ先に貼っておきます。
>>
The authors suggest that STAP cell-derived TS-like cells are distinct from embryo-derived TS cells, but the data for this are not decisive and could be attributed to persistent contamination with STAP cells or ES cells (which could expain the occasional Nanog positive cells). Presence of ES cells could be excluded by culture in the presenve of JAK inhibitor, and monitored by Oct4 and Nanog immunostaining.

[連絡2]
(続き)A global transcriptome anallysis could then be performed for comparison with TS cells. Data should also be provided on Fgf4 withdrawal from the TS-like cells - does this induce the expected differentiation into trophoblast giant cells?

[連絡3]
>>Ooboeさん
ntES化してキメラ作成の成功は若山研では毎日全員で行われていることで、何も珍しくありません。小保方細胞核を使ってntESを作り、そのキメラの胎盤が光ったと思ったから舞い上がっているとみています。これも一言で解説はできません。待ってください。その間ご自説開示願う。以上です。



[連投1]
>>学さん
取り合えず、流出ネイチャー査読文のレターに関する第二レフェリーのコメントのグーグル訳を貼り付けることから始めましょう。
>
著者らは、STAP細胞由来のTS様細胞は胚由来のTS細胞とは異なることを示唆しているが、これに関するデータは決定的なものではなく、STAP細胞またはES細胞の持続的汚染に起因する可能性がある ( 時折あるNanog陽性細胞がそれを証している）。 ＥＳ細胞の存在は、ＪＡＫ阻害剤の存在下での培養によって排除することができ、そしてＯｃｔ４およびＮａｎｏｇ免疫染色によってモニターすることができる。次に、TS細胞との比較のために包括的なトランスクリプトーム分析を実施することができる。TS様細胞からのFgf4を除くととうなるかのデータも提供されるべきです - これは栄養膜巨細胞への予想される分化を誘導するだろうか？

[連投2]
この査読文の日付は2013年4月4日で、手記118Pの日付とも一致しています。小保方さんは同じページで論文原稿のウェブ投稿を終えたのが3月11日の夜中だと書いていますね。この論文は笹井さんがリヴァイズした文章です。特にレターに関しては小保方さんが事前に渡していた未完成論文の文章は全く残ってないと記者会見で答えています。でも、言わんとする内容は変えてないとも言ってますね。笹井さんは文責があるんです。科学的に明らかな間違いがあったら世界の笹井さんの知識によって訂正されていると考えていいわけです。ここに誤りがあるときには笹井さんの錯誤と言っていいわけですね。
Extended Data Figure 5の実験結果は最初の投稿時原稿に無かったという事実はご了解いただいたと思います。つまり、JAKiを使った実験は2013/4/4以後に行われているんです。同様にFigure 2-i,j,kも無かった。学さんが提示されているこの件に関する本文のグーグル訳も貼り付けましょう。

[連投3]
>
しかしながら、Fgf4誘導幹細胞は、樹状図においてSTAP幹細胞と栄養膜幹細胞との間に位置しているので、Fgf4誘導幹細胞集団におけるSTAP幹細胞の混入の可能性を排除できない。先行する研究では、内部細胞塊（ICM)タイプの多能性細胞は、JAK阻害剤で培養を処理することにより培養物から除去することができることを示した（拡張データ図5a,b）。対して、JAK阻害剤処置は、Fgf4誘導幹細胞培養のOct4-GFPの発現には実質的な影響を及ぼさなかった。（拡張データ図5c,d;コントロールとして拡張データ図5e,f参照)。どの多能性マーカー（図2j）や栄養膜マーカー（図2k）も実質的影響を被らなかった。これは多能性マーカー発現がSTAP幹細胞（ICMタイプ）を反映している可能性の低いことを示している。それを証明するように、栄養膜マーカーであるItga7（ES細胞ではなく、栄養膜の表面マーカ）に対して強く陽性であったFgf4誘導幹細胞はOct4-GFP（拡張データ図5g）を高レベルで発現した（拡張データ図5g)。

[連投4]
第二レフェリーはSTAP細胞かES細胞がコンタミしている可能性があると言ってますね。その理由として時折Nanogの出ているデータがあると指摘している。で、もしESのコンタミならJAKiで取り除けると言ってるんですね。 could be excludedと表現している。取り除くという意味ですね。constitutively expressed BFP (the number of plated cells was one-tenth of that of plated Fgf4-induced stem cells)も存在していてはいけません。ただし、査読者はcouldと言ってますね。できるんじゃないかと言ってる。

[連投5]
他方、笹井さんは論文の中でどう言ってるかというと、「STAP幹細胞の混入の可能性を排除できない」と言ってるんです。査読者はESのコンタミでないことをJAKiで検証したらとアドヴァイスしているのに、笹井さんはSTAP幹細胞のコンタミがないことをJAKi検証したと書いている。ところが、実際の実験ではSTAP幹細胞は使われていませんよね。私が笹井さんの錯誤と言ったのはこのことで、錯誤には錯誤の原因がありますよね。ES細胞のコンタミはありませんという論文記述はできないんですね。どうしてかはお分かりですよね。コンタミなんてあり得る実験環境はラボとして最低です。そんな可能性があるかもしれないからと自分で言うような論文はあり得ません。そんなことする前に実験の基礎から勉強し直せと言われてしまう。

[連投6]
でも、笹井さんは論文を通してやるのが使命です。査読者の言ってることを笑止というわけにはいきません。そんな態度ではリジェクトされてしまう。ご機嫌は取らないといけませんね。文責は笹井さんですね。実際にはESの実験しかしていないのに、本文ではESという言葉をSTAP幹細胞という言葉に置き換えたんです。その時にレトリックを駆使した。
<先行する研究では、内部細胞塊（ICM)タイプの多能性細胞は、JAK阻害剤で培養を処理することにより培養物から除去することができることを示した（拡張データ図5a,b）。>と書いていますね。<内部細胞塊（ICM)タイプの多能性細胞>ってESのことですね。注意深く読むと、直前のSTAP幹細胞を受けているのではないと分かりますよね。もしそうなら間違いになる。STAP幹細胞はICMタイプではありません。彼が微妙な作文をしていることに気づかれると思います。

[連投7]
そして、続く<対して、JAK阻害剤処置は、Fgf4誘導幹細胞培養のOct4-GFPの発現には実質的な影響を及ぼさなかった。（拡張データ図5c,d;コントロールとして拡張データ図5e,f参照)。どの多能性マーカー（図2j）や栄養膜マーカー（図2k）も実質的影響を被らなかった。>という文章も単独では嘘にはなっていないですね。宙に浮いたのは「TAP幹細胞の混入の可能性を排除できない」という文章で、この結末はどこにも落ちていないし、実験も示されていない。

[連投8]
先行する論文は参照文献で示されているが、この論文がレフェリーの言っているように、Presence of ES cells could be excluded by culture in the presence of JAK inhibitor, と主張しているかどうかは、我々が読んでも別問題だと分かりますが、笹井さんならもっと分かっているでしょうね。でもリジェクトされない作文が必要ですね。でも、そもそもそんなことしていいんでしょうかね。

[連投9]
学さんが先へ先へ進まれていることは承知しています。学さんらしく直感的表現で、と問われた真意は分かっています。アーティクルのアブストの中に以下の文章があって、彼の内心の葛藤を漏らしたものと思っています。彼は万が一に備えて自分のことを告白しているんですよね。
>>
Thus, our findings indicate that epigenetic fate determination of mammalian cells can be markedly converted in a context-dependent manner by strong environmental cues.

[連投10]
この実験は2013/4/4以後に行われている。Ooboeさん。したらばでの桂報告書の35の間違いを思い出してください。スライドにあるは2013.6ですから訂正を要求しないといけないと申し上げた。本文には6月とあるのにここで1月としているのは間違いを装った虚偽である可能性すらあるとお気づきですか?もどかしいですが書き込み量制限があるので明日にします。以上です。因みに<以上です>が無いまま止まっているとき、私は書き込めない状態に陥っていると判断されてください。以上です。

1. 2019/06/01(土) 07:52:10|
2. 学さんブログ検討記録
4. | コメント:0

[連投1]
>>学さん
素晴らしい場を提供していただいて本当に感謝します。まず確認しなければならないことは、この実験は若山研で行われたものではないという事実ですね。Extended Data Figure 5-a,bの写真はOct4-GFPですね。小保方さんはOct4-GFPのESを若山研で入手はしていませんね。小保方さんが持っているのは学生が作って小保方さんがもらったと言われているOct4-GFPのntESです。さらにExtended Data Figure 5-e,fに使われているGFP/BFP共挿入マウスのESも小保方さんは若山研では入手していません。提供者は丹羽さん、もしくは笹井さんですが、ほぼ丹羽さんだと思われます。というのは公共データ登録されているTSはマウス背景がCD1と書かれていて、これは若山さんが作ったと言っている129B6F1CAGホモマウス背景のTSが分化していたため丹羽研から提供されたと報告されていますね。

[連投2]
因みにこのTSは私があのねさんに提供した分類で以下のようになっています。
>>
Tru-Seq
⑬SRR1171590　丹羽研?　Trophoblast Stem Cells:RNASeq.Rep1　CD1　(129xB6-CAG-スライド)
⑭SRR1171591　丹羽研?　Trophoblast Stem Cells:RNASeq.Rep2　CD1　(129xB6-CAG-スライド)
ChIP-Seq
⑯SRR1171592　丹羽研　Trophoblast Stem Cells:ChIPSeq.H3K27me3　CD1　(CD1系統-スライド)
⑰SRR1171593　丹羽研　Trophoblast Stem Cells:ChIPSeq.H3K4me3　CD1　(CD1系統-スライド)
⑱SRR1171594　丹羽研　Trophoblast Stem Cells:ChIPSeq.input 　CD1　(CD1系統-スライド)

[連投3]
5件ともCD1とデータ登録されているんですが、Tru-Seqの分析結果は129xB6-CAGと分かりましたから若山さんのTSのようですね。ChIP-Seqは登録名と中身の検査結果が一致していて丹羽さんのものと分かる。公共データ登録は通常は論文の著者が直接行うものですが、小保方さんは直接でなく、2013/11/5に理研に提出していて、理研はそれを2014/2/13にNCBI に提出していますね。つまり間に人が介入しているんです。このデータベースのマウス背景記載はF1がすべてとされていて雌雄が逆になっている。Ooboeさんのパートナー氏には是非小保方さんが理研に提出した時のデータ資料を開示請求してもらいたいものですね。

[連投4]
私がGFP/BFP共挿入マウスのESの背景がCD1ではないかと申し上げている理由はお分かりだと思います。遠藤論文が分析したデータは以下ですね。桂報告はTSであるとは言ってない。TSはCD1だと併記しているだけです。でも遠藤さんはこれをTSだと論文で主張しています。そしてその根拠たるや、TS特異的マーカーであるSox21とElf5が発現しているからだと説明したのです。
>>
Tru-Seq
⑦SRR1171565　若山　FI-SC(Fgf Induced Stem Cells):RNASeq.Rep1　Oct3/4 expressing cells　C57BL/6x129/Sv　(GOF+CD1-桂報告書)
⑧SRR1171566　若山　FI-SC(Fgf Induced Stem Cells):RNASeq.Rep2　Oct3/4 expressing cells　C57BL/6x129/Sv　(GOF+CD1-桂報告書)

[連投5]
Extended Data Figure3-bのヒートマップの下から1/3の辺りにPou5f1(Oct4)がありますね。CD45,ES,STAPの順に並んでいますが、右端のスケールで、CD45は2-4レヴェル、ESは10-12、STAPは4-6ですね。2を底とする対数表示ですから、リニアにはCD45は4-16、ESは1024-4096、STAPは16-64です。ESの0以上の発現遺伝子を真ん中に置いてESと同じ発現遺伝子に関してCD45とSTAPを比較している。これを見ると丹羽さんの後の検証確認と一致していますね。ESと比較したらSTAPは格段少ない。でも今はそのことを論じているのではなくて、Pou5f1(Oct4)はES特異的遺伝子であるが、Pou5f1(Oct4)が発現していたらESなのではないということの根拠として指摘しているんです。遠藤さんの論拠を思い出してください。TS特異的遺伝子が発現していたらTSだと言ってるんですよ。非論理も極まっている。

[連投6]
遠藤論文はネイチャーで一蹴されて日本分子生物学会主催のGenes to Cellsに拾われた。STAP論文記者会見発表後に竹市さんのところに連名のメールを送った先です(手記142P)。当時の理事長と副理事長が大隅典子氏と中山敬一氏ですね。前者は東北大学、後者は九大でNHKの番組にも出てましたね。因みにBCA報告の松崎さんは東大ですが、理研に来る前は東北大で教鞭をとってましたね。
ここで、見落としていたあのねさんへの返事をさせてください。
>>
一言さんは、若山氏の、小保方さんに真実を告げられないままの論文が笹井さんが入る前、NatureやScienseに投稿していた時点で仮にリバイスされることは若山氏の中に微塵もなかったとの認識ですか？
2019/4/2(火) 午後 9:45[ あのね ]返信する

[連投7](入れなくなってました。続きです。)
そう思っています。一蹴されるレヴェルだと思っていたはずです。若山さんも査読する立場の人ですからね。自分でやってできなかったものを、できたことにして論文提出させている。落ちるに決まってる。実際の事実は自分が一番知っていますね。現にけんもほろろでしたね。若山さんは小保方さんをヴァカンティから切り離すこと事だけを考えていたんですよ。論文を提出したら縁が切れるような説明を小保方さんから受けていますよね(手記81P)。ニュアンスは分かりませんけどね。若山さんはあきらめていません。キメラができないことがはっきりした後に、当時はまだ人事秘だった山梨大への転勤の内示を発表できるまで小保方さんを引き留めたいと思ってntES化実験のことは何も話さないでキメラができたと嘘をつき、翌年の転勤発表の時に助手で来いと誘ってますね。若山さんは二つ返事だと思ってたでしょうね。ここで小保方さんが即答しなかったことが話がこじれて行った原因だと思っています。

[連投8]
話を戻します。Extended Data Figure 5-a,b,c,dはESのOct4はJAKiの添加で消えるがFI-SCは消えないというものです。私が錯誤という言葉を使ったことが学さんの誤解を生んでいるようですが、ここの部分の本文は以下ですよね。
>>
However, as Fgf4-induced stem cells lay between STAP stem cells and trophoblast stem cells in the dendrogram, the possibility of contamination of STAP stem cells in the Fgf4-induced stem-cell population cannot be ruled out.

[連投9]
笹井さんが一からリバイズしたとされる本文で、コンタミが疑われるからとされているのはSTAP幹細胞で、ESではありませんね。それにそもそもSTAP幹細胞はインナーセルマス由来細胞ではありませんよ。JAKi検査される対象ではありませんよね。しかも、現にSTAP幹細胞のJAKi検証なんて行われていませんね。
この実験ではGFP/BFP共挿入マウス由来のESが使われている。提供者は丹羽さんか笹井さんですね。若山研にはないはずのESです。この実験をさせたのは笹井さんと丹羽さんで、この原稿をちゃんと見ているはずですね。若山さんは記者会見で、レター論文には自分のところでは行えない実験が入っている言っていると述べていますが、ここのことですね。

[連投10]
論文の趣旨に沿って、Extended Data Figure 5-e,fを見てみましょう。ここはいろんな人が指摘しているところですが、FI-SCのOct4-GFPはJAKiの添加で消えませんでしたよね。e,fで使われているFI-SCは無論c,dで使われたものと同じですね。白の矢印の先にFI-SCがある。矢印はブライトフィールドでの同じ位置を示していますね。eの中段はOct4-GFP細胞ですからJAKi添加前も後も光ってないといけませんね。c,dと同じ結果でないといけない。でもどちらも光ってない。最下段はどうかというと、これはブルーのフィルターなんですからどちらも緑色蛍光は見えないのが当然です。ここは問題ない。

[連投11]
そしていよいよGFP/BFP共挿入ESです。青の矢印の先にある。これはESですね。GFPに関してはa,bと同じ結果にならないといけない。つまりJAKi添加前には光っているが、添加後には消える。中段の画像はその通りになってますね。ではBFPに関してはどうなるのが論旨でしょうか。ESなんですからJAKiが添加されたらGFPと同様にBFPも消えないといけませんが、最下段のJAKi添加前はちゃんと光ってますね。でも添加後も光ってるのはどうしたことでしょうか。この実験は笹井さんも丹羽さんも見ている実験です。私が錯誤と言ってるのはその意味です。これ以上書き込むと機械にリジェクトされそうです。以上です。明日、また続きを書きます。

1. 2019/06/01(土) 07:47:24|
2. 学さんブログ検討記録
4. | コメント:0

[連投1]
>>学さん
>遠藤解析によると、FI細胞のSNIPsをB６、non-B6との分類法で分けると、TSマーカの各SNIPごとのばらつきがみられることから（図2Cを参照）、FI細胞中の混入TS細胞は、B6でも１２９でもないマウス由来（CD1）との判定になるのです。

少なくともSox21に関してはESはいうに及ばず、他の細胞にも発現があって、Sox21が出ていたらTS細胞であるという意味で、Sox21がTS特異的マーカーであるという遠藤さんの主張はTs.Marker さんによって否定されましたね。ただ、Sox21がTS細胞内で重要な働きをしているという意味で、TS特異的マーカーであるかもしれないのは後の論文が明らかにしつつあるということですね。

[連投2]
遠藤論文が10%のCD1はTSであるという根拠はもはやElf5だけですね。Elf5はどんな場合もESには出ないのですか。Elf5は確かにTS特異的マーカーだと小保方論文には書かれています。ある幹細胞に特異的なマーカージーンって何でしょうね。Oct4が発現していたらES細胞なのならSTAP細胞はES細胞だということになります。ES細胞にはOct4の発現があるということですよね。逆は真ではない。そういう間違いが多い。Letter Extended Data Figure 5-e,fのGFPとBFPの共挿入ES細胞の入ったGOFのFI-SCではないのですか。これは若山研に無いESですから丹羽研の提供だとすると、CD1のTSも丹羽研提供ですから、このESもCD1であった可能性はありますよね。無論GOFのFI-SCはあったに決まっている。だって、小保方さんは黒いマウスを渡されているんでしょ。彼女は混乱の中で若山さんをかばうために何を渡されたか知らなかったとまで答えていますね。なんてかわいそうなんだろう。以上です。



[連投1]
>>楠本さん、Ooboeさん
>自分は全くのど素人なので・・・
>どれが漏れ出し画像なのかがよくわかりません・・・

Ooboeさん、お久しぶりですね。一度に大量投稿するとスパム的なものと機械が判断するようです。1,2日間書き込めなくなるので、一日の投稿量を自粛しています。
お問い合わせの漏れ出しの原理は分かっていません。世界中で誰にも分っていないという意味です。ニュートンは人間の知っていることは浜の真砂の一粒に過ぎないという意味のことを言っています。丹羽さんが初めて見つけましたが、理研での検証目的が違うので、原因究明はされないままに事実報告をされただけです。分かったと言ってる人は今のところ私は知りません。ただ、GOFマウスを設計した人は心当たりがあって報告されているか、何か調査中なのかも知れませんね。

[連投2]
まず最初に自家蛍光についてですが、死細胞は自家蛍光を発します。自家蛍光は死細胞だけではありませんが、今は死細胞だけに絞りましょう。次に当たり前ですがGFPは緑色にしか蛍光しません。そして自家蛍光は様々なスペクトルを出すということです。緑色に蛍光している蛍光顕微鏡映像を赤色フィルターに切り替えたとき、何も蛍光してなかったらもとの緑色蛍光はGFPの蛍光です。もし、赤色蛍光がでていたらそこには自家蛍光が含まれているということですね。
注意すべきは"含まれている"のであって元の緑色蛍光像にGFPの蛍光が無いということではありません。その識別はフィルター切り替えだけでは不能です。必要ならPCRでGFPの人工遺伝子の発現もしくは、免染でGFP蛋白質の存在を確認しなければなりません。

[連投3]
更に、注意すべきは死細胞は自家蛍光を発するが、死にかけの細胞は自家蛍光は発しません。以下は根本さんの紹介している有志の会の記事です。
>>
理研の広報室に自家蛍光の特徴を聞くと「死滅発光はだいたい一時間から三時間くらい。」との事

論文に添付されているライブセルイメージング編集動画において、3時間というのは30分インターバルの方で6コマ分なんですが、一秒間のコマ送りはほぼ9コマです。自家蛍光はその都度1秒間以内で消えているんです。マクロファージが掃除してしまうんですね。マクロファージは酸浴に強いみたいですね。

[連投4]
死にかけてるということはまだ生きているということです。そしてここでも注意すべきは、死にかけの細胞はOct4遺伝子を発現しOct4蛋白を作ることがあると言われていますが、これ自体は自家蛍光ではないということです。今、自家蛍光とGFPの話をしています。混同しないでください。GFPの蛍光と、内在性Oct4の発現もしくはOct4蛋白の発現を区別しましょう。
緑色蛍光に関して、以下の現象がありうるわけです。
①GFPのみの発現
②GFPの発現と自家蛍光の混交
③自家蛍光のみの発現
④丹羽氏発見の"常時"5から10%のGFP漏れ出し

[連投5]
①は赤が無ければGFPの蛍光ですが、④が常時あるということです。②と③は見ただけでは区別できません。④こそ、誰もが騙された当時未知のアーティファクトだったということです。
ここでもっと重要なことを確認しなければなりませんね。①だったからと言ってSTAP細胞が多能性細胞であるということには全然ならないということです。ES細胞は常時Oct4を発現しています。多能性維持のために不可欠な蛋白質だとされているんでしょ。でもOct4が発現したら、それは多能性細胞なのか。逆は真ではない。
STAP細胞が多能性細胞とされたのは遺伝子発現解析によるのではありません。若山さんがキメラを作って、スタンダードな方法でできたと言ったまま、それが一度も真実を告げられないままに論文化され、笹井さんの信用力でネイチャーに通ってしまったからです。キメラができたから多能性細胞なんです。

[連投6]
沢山の人々が無意識にか意図してか、遺伝子解析結果から結論を導こうとしていますよね。これはレター論文を一から一言一句リヴァイズした笹井さんですら陥っている錯誤です。無論、笹井さんと丹羽さんの場合は、キメラができているという大前提があっての錯誤です。その証拠に手記127Pに丹羽さんの「浅い解析」という言葉が書き留められていますね。どうしてそんな「浅い解析」を放置できたか。若山さんがキメラができていると言ってるからです。その根本が動かない限りは遺伝子解析は後にちゃんとやればいいという判断になる。でも、キメラはスタンダードな意味ではできていないということだったらどうなるでしょう。
もし、レター論文の遺伝子解析結果だけでこの細胞は多能性細胞だなんて主張したら物笑いの種でしょう。若山さんはスタンダートな意味でできてないことを知ってるから、こんな論文は通るはずがないと思っている。他の人々はキメラはスタンダードなプロトコルに従ってできている。だからそれが通らないのは論文の書き方によるのだと思っている。

[連投7]
本当はキメラを何べんでも作って見せたらいいだけじゃないですか。それが実証科学というものだ。でも、書き方が悪いから通らないとされたら、通せと言われた人々はキメラ作成以外で査読者に疑われているところを掘り下げて説得するしかない。そんなことで論文が通ったら変でしょ。だから若山さんは通らないと思っていた。あるいは通らないことを祈ってたかもしれませんね。でも通ったんですよ。笹井さんと丹羽さんのクレジットが加わったからです。
もう書きすぎてますね。次回にしましょう。Ooboeさんの私の論考に関するご理解はほぼその通りです。以上です。

[連投8](昨日の続きです)
>>楠本さん、Ooboeさん

加えて、後の丹羽論文が発見した小保方細胞に関する新知見は、GFPの発現とは離れて、一回の実験で約30個のスフィア塊ができ、ひとつの細胞塊が約千個の細胞で構成されているとして、30000個の細胞総数ですが、その中で内在性Oct4遺伝子の発現量は、スフィア塊30個の20%、すなわち6個のスフィア塊の中に散在し、細胞個数に換算して6から12個分だということです。
小保方さんはハーヴァード時代に一回にこの30個程度のスフィア塊をたくさん作り、ひとつづつシャーレで培養してそのなかの20個に一つ50個に一ついう確率で三胚様分化を導きました(手記53P)。この結果は丹羽さんのPCR検証結果と一致していますね。このハーヴァード時代の細胞が何であったかはまだ分かっていません。小保方さんは震災がなかったらその研究を進めていたことでしょうね。

[連投9]
若山さんは真実を語るべきチャンスを逸してしまった。それは竹市さんが小保方さんをURLにしたらと言ったからですね。竹市さんには罪はありませんが、若山さんにも罪はないでしょう。これって仏教の言うところの縁起ですよね。利害関係者らしいオホホ・ポエムに以下のようにありますね。
>>
「世に倦む日々の人、竹市のこと信用してたのね。御愁傷様」
「竹市は本件をここまで深刻にした張本人です」
「ＣＤＢの小保方擁護筆頭、未だに現実を受け入れられない。今日も相澤研までわざわざ小保方に会いにいっちゃったり」
「もうホント馬鹿じゃないかと」
「で、細胞の調査をすることには絶対反対ね。認めてもしぶしぶ。ＣＤＢは５月末になってからやっと細胞の調査を始めた」
「けれど、若山にプライマーの配列聞いてたから、一瞬で元のＥＳが同定ｗｗｗ」

[連投10]
情報は寺下さんからも入るんですね。無論寺下さんは若山先生方と単なる電話での会話をしているだけですね。それだけで情報は伝わる。
小保方さんが米国に帰ったところまでで何もとりたてて世間を騒がせるようになる要素はなかったところに、竹市さんがたまたま倫理委員会の席上で興味を持っていたところに、西川さんから小保方さんが米国に帰ったという話を聞いてURLに採用したらといったことが、オホホ・ポエムが<「竹市は本件をここまで深刻にした張本人です」>と言っている真意でしょうね。本音がでてますね。でも、因縁ですよね。倫理委員会で検討されたのは若山さんが自分の血液でSTAP細胞を小保方さんに作らせたことが機縁ですよね。因果は巡る。西川さんが最初に理研を辞任したのもこのURLの契機を作ったことが後ろめたかったんでしょうね。無論、こういうのは偶然に過ぎない。躓いたのは道端にあった石が悪いのかに類した話にしかならない。

[連投11]
繰り返しになりますが、若山さんは小保方さんに惚れ込んでいて山梨大に連れて行きたかった。向こうに連れて行ったら本当のことが言える。そしてちゃんとした論文を書かせてやろうと思っている。でも、ヴァカンティの手前、あれは何かのコンタミだったんだよと言い訳する準備もしておかなければならない。ところが小保方さんはどうも日本の研究室の因習が好きでなかったようですね。ヴァカンティのもとに帰ってしまった。助手の誘いをちゃんと断らないままにプイとヴァカンティの元に帰った。これは小保方さんを擁護する私であってもいくらなんでも礼儀を知らんと内心怒るでしょうね。ここは若気の至りも過ぎてると思いますね。礼を尽くして説明して断らないと失礼ですね。あれだけ世話になっておきながら、黙って帰るのか。そして他者の口を通して断ってくるのか。今まで引き延ばしてきていたのは何だったのか。

[連投11]
手記239Pに相沢さんが小保方さんに対して「身から出たサビだ」というくだりがあります。小保方さんは再現実験中に相沢さんのチームに所属していて、相沢さんは大学の大先輩だということもあっていわゆるベイビーシッター役を仰せつかっていますから、小保方さんから今までの経緯を聞いていて、気づくところがあったんではないですか。孫くらいの年の差です。
ここはどんな経緯なのかの調査がありませんから一方的な言い分だけを強調するのはよくないかもしれませんが、若山さんは総じてずっと小保方さんに対して優しいですよね。人に対して優しくて、相手のわがままに対して宏量の人ほど一旦憤ると内心収まりませんね。こういう人は我慢強いので本心を表情や語気に出したりはしませんよね。

[連投12]
こういう話は巷にあふれていて珍しくもない話ですが、そういう下世話なことも考えておかないと事件の全体像はつかめないかもしれませんね。
追い詰められて仕方なかったとはいえ、若山さんは用心のためにサンプルの中身を入れ替えています。この入れ替えが無いということが証明されていたら犯人は小保方さんですよ。その意味では桂チームの細胞の由来に関する解析結果は見事なものです。ただ、入れ替えがなかったことが一切証明されていないばかりか、理研はそれに関する問い合わせに対して言を左右にして答えませんから、この解析結果はA=Aだという馬鹿げた結果しか意味し得なくなっているんです。

[連投13]
入れ替えは一方的に若山さんが悪い。でも、相手は自分に対してあんなことしたやつだよということになるでしょう。万が一論文が通ってしまって、捏造だと騒がれたときはどうするのか。キメラは自分がntESで作ってしまっている。これはESコンタミだったと言い逃れるしかないですね。よく小保方さんに対してそんな冷たいことができるなと思う人は、では小保方さんが若山さんに対して何をしたかを思い出さないといけませんよね。だからああいう下世話なことも考えておく必要があるわけです。
若山さんは本心では論文が通らずにうやむやになることを望んでいたと思います。でも、内偵させていることにもなっている小保方ラボの寺下さんから論文は通りそうだと聞いていますよね。

[連投14]
2013年8月に笹井さんにレターの件をむにゃむにゃと話したが、理解してもらえなかったということで、笹井さんにも責任著者の一人になってもらって、いよいよ通ったらもう捏造論文だとして取り下げ方向にもっていくと決めて、11jigenにもリークしておいたということで、だから記者会見発表後すぐに大騒ぎになったわけです。
では若山さんはいつからそんな準備をしていたのか。最初はヴァカンティの特許仮申請ですね。あれは何かのコンタミだったようだという言い訳ストーリーを考えて、小保方さんに渡されたマウスがホモであるとにおわせた。ヴァカンティに対してはキメラができたのはコンタミだったと説明し得るようにするためですね。これはFLSのジャームライントランスミッション実験で、キメラの成長を待って行いますから5月から6月頃です。

[連投15]
ネイチャー論文ではマウス背景はGFPに関してヘテロだけしかありません。小保方さんはホモであった可能性を若山さんからにおわされて試料ラベルに+/-表示をしていますね。実際にはヘテロに結果が来たんですから論文にヘテロ表示している。ではホモであったということはいつ分かったのかというと、事件後の若山記者会見の席上です。僕のマウスはホモだったと言い出した。それならどうして論文を早く修正させなかったのかと言いたくなりますよね。責任著者でしかも実験の実行者じゃないか。
論文原稿も修正させず、ジャームラインがホモのはずがヘテロに来たと小保方さんに口頭でいっただけで事件化するまで何も言わなかった。なぜか。この言い訳は小保方さんが山梨についてきてくれていたらヴァカンティにする予定だった言い訳だからです。竹市さんが小保方さんを論文ごとURLにして奪い去った後にする予定だったものではないが、もはやそれしか道が無くなっていたんですよ。

[連投16]
その後、そのホモマウスで胎盤実験とFI幹細胞実験をして、コントロールESとTSを作った。更に2012年8月にはAC129の実験で小保方さんがそれをコンタミしたとしているが、この時の実験は小保方さんはキメラができていてローザだと思っている。AC129は後から作られたものかもしれません。というのもFLS-TとこのAC129は若山さんが山梨で持っていたコントロールES株129B6F1ES-1で作られている。AC129は山梨で作られて、後に理研に戻された可能性があるんですね。木星リストの謎となってDORAさんが疑義していたところですね。以上です。私は先頭のJAKiのスレッドに行きます。こここそ、私の本当に知りたかったところなんです。
"学さんにお願いですが、あまりどんどん先に進まないでください。私は応答するのに
書き込み量制限があるんです。以上です。明日JAKiのスレッドに行きます。"

1. 2019/06/01(土) 07:39:50|
2. 学さんブログ検討記録
4. | コメント:0

[連投1]
>>楠本さん
>追記
ご存知だと思いますがこのブログの画像はパートナー氏が理研に開示請求した検証実験時の画像でスタップ論文の画像とは違います。

分かっています。私がSTAP論文のArticle Extended Data Figure4-dをいきなり持ち出したので説明不足が生じたようですね。

[連投2]
小保方さんはいつもの通りに酸浴させてSTAP細胞塊を作っていますから、ネイチャー論文のも、検証実験時の開示分も、STAP HOPE PAGEにあるものも、また相沢さんの論文のも、丹羽さんの論文のも、みな同じものです。論文のdimに関しては
①GFPの漏れ出しに強い発現と弱い発現が2対1程度にある。
②GFPの発現細胞の中に真正の内在性Oct4遺伝子発現細胞がごくわずかある。
と、解することができます。論文にはSTAP細胞からたくさんのテラトーマができていると書かれていますね。それがArticle Extended Data Figure4-dに掲げられている。

[連投3]
小保方さんはSTAP細胞に関してはずっとヴァカンティ足場を使用してテラトーマを作っています。なぜ、丹羽さんの指摘したようにあんなに少ない細胞からテラトーマができるかの秘密がヴァカンティ足場です。足場に培養液を含ませて5万個のスフィア構成している細胞を載せて、足場ごと皮下に埋納する。このやり方で、3/20、8/20できた。dimだけを使った結果は0/10ですね。実質的にはこのテラトーマライクは三胚分化実験に近いものですね。

[連投4]
なぜ漏れ出しというアーティファクトに強弱があるのかも含めて、漏れ出しの原理自体は分かっていません。
この酸浴実験というのはGOFのスペックとして想定されている実験ではありませんから、亜致死下に細胞を置いてもちゃんとGFPはOct4遺伝子と相関して働くなどということは確認されていない。プロモーターとの相関はあっても、そもそも核腔からmRNAが出てくる仕組みはそんなに単純ではありませんから、酸浴下でも、生きていて通常の環境にある細胞と同様に出てくるという保証はありません。これは専門家が研究すべき事柄なのであって実験もしないど素人が可能性を論じても取り留めないだけではないて゜しょうかね。以上です。



>>楠本さん
お返事がないところを見ると御納得がないということでしょうね。分かっていないことが含まれたままの状態で説明するのが難しいのですが、GFPの漏れ出しに関しては原因は分からないということです。でも、そのこととは別に、論文のテラトーマは本物であり得るということを申し上げているつもりなんです。なぜなら小保方さんは理研に来る前からヴァカンティ足場を使ってテラトーマライクを作っていますから、理研での酸浴時にも今までの物理刺激の細胞が含まれているならテラトーマライクはできるんです。その結果がアーティクルの表だと理解しているんです。以上です。

>>学さん
<あのね説続き2>に私の返事を送っています。アップしていただけませんか。あのままだとあのねさんは気づけません。以上です。


[連投1]
>>学さん
早速アップしてくださって有難うございます。今度は学さんへの返信です。
>
①②③のどれであるかわかりません。当事者は沈黙してますから。
しかし、実は、ここが一番大事なんです。何があったのか明らかにされないまま、小保方氏はESで捏造したとの話になっちゃったんです。STAP細胞の不可思議な点を、小保方氏の悪行に持ってかれちゃったんです。ＣＤＢ挙げての大捏造でなければ、ES説は可能になりません。ここを多くの一般人にわかって欲しいです。

[連投2]
①②③というのは以下です。
>>
①ESコンタミだった。
②本当にできていた。
③ntES化されていた。(或いは若山さんの他の技術であっても、論文に書かれているものでない実験が行われていた。)

当事者たちはたくさんしゃべっていると思います。その証言同士が互いに矛盾しているところから誰が犯人かを演繹できると思います。学さんは私とは所見が違いますが、私の申し上げていることをいち早く理解して、先へ先へとスレッドを作ってくれていますね。その時に我々ど素人の理解の難しいであろうところをかみ砕きながらついでに教えてくれてますね。大変ありがたく思っております。

[連投3]
まず①に関しては、これを主張しているのは桂報告書で<当事者は>調査チームであって、決して<沈黙して>いません。ご承知の通りBCA報告に至ってはタイトルがSTAP cells are derived from ES cellsとそのものです。調査チームの調べた細胞同士の関係は以下であったと主張しています。
①FLS→FES1(太田さんが実験にも使用せず作ってみたとされている岡部マウスとのF1由来受精卵ES細胞)
②GLS→GOF-ES(学生が小保方さんに渡したntES)
③CTS→FES1(太田さんが実験にも使用せず作ってみたとされている岡部マウスとのF1由来受精卵ES細胞)

[連投4]
④AC129→129B6F1ES1(若山さんがFLS作成に関して作ったと主張するGFPホモのコントロールES)
⑤FLS-T→129B6F1ES1(若山さんがFLS作成に関して作ったと主張するGFPホモのコントロールES)
⑥12/27テラトーマ→FES1(太田さんが実験にも使用せず作ってみたとされている岡部マウスとのF1由来受精卵ES細胞)

[連投5]
この報告は分析結果そのものは正しいのですが、サンプルの中身に関して真正性がまったく担保されていなくて、証拠能力がありません。このことは桂報告書が出てすぐに和モガさんが、これは中身が同じだと証明しただけで、中身の入れ替えが行われていないという前提の証明が無いと指摘されました。
その後、木星さんが、若山さんと理研はMTAも交わさずに細胞持ち出しが行われていること、太田ESが山梨大に送られたことまで調査し、Ooboeさんのパートナー氏がもっと深く調査して、結局、太田ESに関してはすべての試料が山梨の若山研経由していることがはっきりしました。加えて理研が太田さんに細胞を渡し、その容器を太田さんが理研に返していることまで突き止めています。

[連投6]
桂報告は事故コンタミであったことを可能性として否定していません。本人が全部持ち出したと言っている太田ESが使われていると主張していていながら、そんな置忘れサンプルがなぜ事故で解凍されるのかということを不審にも思わずに事故コンタミの可能性を残した非論理に彼らの嘘のしっぽが出ています。
事故でなかったら犯人がいるということです。ここで既に桂報告の論理は崩れています。事故なら犯人追及は不要で、実験に関わった若山さんか小保方さんが原因である可能性が一番高いのですから、どういう経過の実験であったのかを調査するだけで原因は分かります。そして原因が分かったら調査報告して終わりです。ところがそちらはやってない。

[連投7]
なぜ事故コンタミの調査をしなかったかというと、事故でないということを知っているからですね。無いはずの太田ESが使われていると分析結果が出たんだから、だれがこんなものを持ち込んだのだと考えるのが普通です。すると置忘れしかない。置き忘れられた細胞を誰かが使ったんだから、これを解凍した人は故意に解凍したに決まっている。そんなものを事故で解凍のしようがないでしょ。だから犯人は居ると知ってるんですね。
犯人の候補は三通りしかありません。
①若山さん
②小保方さん
③第三者

[連投8]
これですべてを尽くしてます。若山さんが太田ESをポトリと落として小保方さんのために偽キメラを作ってやる動機なんて知られていません。ラボ仲間が客員の小保方さんのためにポトリもなければ、ましてどこかからやってきた見知らぬ人がポトリはなおありません。従って犯人は小保方さんだということになる。だから、事故コンタミの可能性調査をしなかったんです。
では桂報告はどうして小保方さんが犯人だとはっきり言わなかったのか。小保方さんが訴訟するに決まっているからそれを逃れようとしたんですね。だから犯人は分からない、事故コンタミもあり得るとカモフラージュしました。自分たちは小保方さんが犯人だとは言ってないと暗に主張しているんです。小保方さんは抗弁しにくいんですね。

[連投9]
本当に小保方さんがES細胞で捏造したと分かっていたらそんなことをする必要はありません。訴訟は受けて立つべきで賠償金も請求できます。彼らは小保方さんが犯人だと証明できてないと分かっていたんですよ。若山さんも怪しいと感じていた。このことは手記227Pに川合理事の証言が書き留められていますね。
理研はたくさんのことを隠していて小保方さんの論文不正という落としどころに落とそうとしているのだということは誰でも薄々感じていることですね。独法の闇があってそれに触れそうになってる。だから文科省が裏でヒヤヒヤしていて蓋をしようとしていて、理研内部の調査チームにも圧力がかかっている。それで論理が支離滅裂になっていて、それでもお前さんたちは博士さんなのかと思わず笑いだしそうになるような非論理を言ってるわけです。これ以上連投いるととまた書き込み禁止になりそうですので今日のところは以上です。明日続きを書きます。

[連投10](続きです。)
桂チームは若山さんが怪しいとも思っていたんでしょうけど、文科省から圧力があって幕引きを迫られた。だから小保方さん犯人説で落としどころとせざるを得なかった。それと同時に若山さん犯人説でntESではないかとまでは気づけてなかった。どうしてかというと若山さんの動機が分からなかったんですね。これが分かったのは手記が出てからです。桂チームはもやもやとしたままで結論を出さないといけなくなって、当然予期される小保方さんからの訴訟を配慮して、それをかわすために犯人は分からないという屁理屈をしつらえた。そして事故の可能性も否定できないとやわらげた。世間は小保方さんが犯人だと思ったでしょうね。論理がそういう基本構造になってますからね。桂報告の内部矛盾に気づけない限りはESによる故意の捏造で犯人は小保方さんだと桂報告が言っていると解すのが普通ですね。これが狙いなんですね。

[連投11]
これで一件落着させたいんでしょうが、世間は納得はしてませんね。世間はこの細胞生物学の専門に関してはど素人ですが、各自みな自分の専門分野は持っていて、そこで使われている論理はこの分野と共通のものです。専門知識の壁に阻まれてしかとはその矛盾に気づきにくくされているから明確にできないんですけど、言ってることが非論理だなということは直感的にわかりますね。
なんかもぐもぐと怪しげなこと言ってるなという感じです。今新しいDORAさんのブログで問題にされている官僚制度の硬直化の問題ですね。いわゆる独法の闇、特別会計の闇ですかね。こちらの問題は世間の方がはるかに知っていて、関係業界にとって仕事がどこから来るかは自分の身につまされる問題で、裏事情はよく知ってる。学会も同じだということくらい一目です。

[連投12]
本当はSTAP事件は官僚制度の硬直化による弊害が遠因かもしれません。でもそんな迂遠なこと言ってても始まりません。
事件は2011年11月に顕微鏡下でキメラ胎児が光ったことから始まりました。CAG-GFPが光ったんです。その次に小保方さんがGOFマウスで作ったSTAP細胞でテラトーマを作ったものからAcr-CAGが出ました。桂報告書はこれをどこにあったかすらわからないFES1の混入と結論した。となると当然最初のF1キメラのGFPもAcr-CAGだということになります。

[連投13]
小保方さんはGOFマウスでテラトーマを作ろうとしているのですから、捏造するなら持っているとはっきりわかっている学生のGOF-ESを使いますよね。かといって若山さんが太田ESで捏造なんてするわけもないということになると、つまり、このAcr-CAGのF1マウスは若山さんが交配したもので、太田ESではないということになるんです。そして若山さんはF1キメラと同時にできたと言われている幹細胞を小保方さんのテラトーマの上から注射したんです。だからAcr-CAGが出たんです。

[連投14]
若山さんはどうしてそんなややこしいことをしているのか。それが分からないから桂チームがもやもやしてたわけですが、文科省の幕引き指示でああいう処理にするしかなかったんですね。このリクルートに関する動機は桂報告時点では若山さんと西川さん以外には誰もはっきりとは知らなかったのではないかと思います。我々世間がそのことを知ったのは手記が出てからで、しかも小保方さん自身はそれが原因だということに気づかないまま正直にあった出来事を書いているだけです。

[連投15]
①小保方さんは2011年の5月頃に若山研に入るよう若山さんから誘われた。
②それが契機で論文が出るまでの間はヴァカンティ研の所属で若山研の客員になった。
③酸浴GFP蛍光に成功したがキメラはできなかったので、どうやら論文をまとめて米国に帰ろうとした。
④そこにナイフ切り分けでできたと言われた。
⑤翌年になって今度は山梨大の助手で来ないかと誘われたが返事を留保した。

[連投16]
⑥4月にヴァカンティが米国特許仮申請した。
⑦ジャームライン確認実験の終わった5月頃若山さんがGFPが半々に来たと小保方さんに言った。
⑧8月頃若山さんが盛んに山梨に来るように小保方さんを勧誘した。ラボ仲間もついていかないとマウスみたいに食べられちゃうぞと加勢した。
⑨11月に小保方さんはヴァカンティの元に帰ってしまったところに西川さんから理研に来いと誘われた。この時まで彼女は若山さんに助手の件を返事していなかった。
⑩そして小保方さんは若山さんのデータを持ったまま理研のRULに採用された。

[連投17]
この話は小保方さんが理研に採用されるまでの間全て内輪の話です。論文も三誌リジェクトされていて全然世間に出ている話ではありません。唯一問題なのがヴァカンティの仮申請だったんですが、これも内内の話しで、あれはコンタミだったらしいで終わり得ることでした。何も深刻なことはないわけです。でも理研が入ってからは後に引けなくなってしまいましたね。
最初のF1キメラが太田ESで作られたものではないということに納得があると、もう演繹的に論文通りの本物でもあり得なくなってます。本物だったら若山さんはあんな記者会見をする必要がないでしょうし、12/27テラトーマからアクロシンが出たのを太田ESだと言われて黙っていることもないでしょう。小保方さんはテラトーマに太田ESを入れるくらいならGOF-ESを入れるでしょうし、若山さんが太田ESコンタミなんてする理由がありませんね。だからntES化の別実験でできたキメラと幹細胞をそれと説明せずできたよと言ったんです。翌年まで引き留めておくための軽い一時的嘘です。

[連投18]
それがわかると、ヒートマップや遺伝子解析の問題で、CD45+細胞と酸浴STAP細胞は小保方さんの作ったそのままの細胞で、STAP幹細胞とFI幹細胞は若山さんのntESなのだと思っての結論にならなければならないということになります。その際に丹羽さんのみつけたGFPの漏れ出しとともに重要なのが、相沢さんの見つけたGapdh値の不安定性です。小保方さんの作ったミンチし、遠心し、FACSソートされたCD45+細胞と酸浴されたSTAP細胞の遺伝子解析はGapdhがあてにならないのに対して、若山さんの作ったSTAP幹細胞とFI幹細胞の遺伝子解析結果は普通に使えるものだということになる。

[連投19]
FI-SCの568のTs.Marker<やっぱりね>分析は若山さんのnt-ESのもともとの性質である可能性があるとみています。小保方酸浴細胞核を使うときに丹羽漏れ出しが前提されていると小保方さんの昔からの真正なOct4発現細胞に当たっている確率はとても低い。つまり、若山さんはただ単に普通のリンパ球の細胞核をクローン胚に入れただけの可能性が高いと推測されるんです。
そして、もしFGF4誘導によって、これに何か胎盤貢献能が付与されたとしたら、それはヴァカンティ研とは全く関係ない、ただ単に若山さんの発見であるにすぎない可能性もあります。そこには胎盤は本当に光ったのかという問題が横たわっているんですね。次の機会に卵黄嚢に関しての小保方さんと笹井さんの行き違いについて考えてみたいと思います。以上です。

1. 2019/06/01(土) 07:30:05|
2. 学さんブログ検討記録
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[連投1]
この場を借りてガンバレの楠本さんへの連絡をさせてください。
>>
学さんのブログで漏れ出し現象について言及しておられますが、OCT4-GFPが強く発現している画像とそうでない画像があると思うのですが、どう思われますか。

GFPの漏れ出しは丹羽さんの発見で、Oct4-GFP人工遺伝子が発現して、GFPという蛍光蛋白質が製造されて、紫外線を当てると緑色蛍光しているにも関わらず、肝心なOct4遺伝子そのものが発現してないという現象で、こちらはPCRで遺伝子の発現を確認し、発現していてもOct4蛋白が製造されているか否かは免疫染色で確認しますが、まずPCRでOct4遺伝子のmRNAが発現していないと言ってるんです。

[連投2]
漏れ出しの発見はそれ自体が一つの科学的発見で、だれかが興味を持ったら調べるでしょうから、丹羽さんはInterestingly と書いているんでしょうね。この調査を通して大発見が無いとも限りません。
どんな遺伝子も先頭にプロモーター配列がくっついていて、このプロモーターが体内の特定の蛋白質の増減に反応して本体の遺伝子が発現したりしなかったりする仕組みになっています。

[連投3]
Oct4蛋白質を製造する設計図であるOct4遺伝子にもそれを稼働させるプロモーター配列があります。対してGFP遺伝子はご承知の如くオワンクラゲが蛍光蛋白質を製造する仕組みを利用して目的の遺伝子の発現と対応させて光らせる人工遺伝子で、Oct4遺伝子がターゲットなら人工遺伝子をOct4遺伝子のプロモーター部位につなげたものをヴィルスベクターを使って核内の染色体に感染挿入させる。これで、内在性Oct4遺伝子が発現するときには、同時にGFP遺伝子も発現するという仕組みができる(人工遺伝子に対して内在性遺伝子と呼び分けている)。これがGOFマウスと呼ばれているものだと理解しています。

[連投4]
若山研ではこのマウスを使ってES細胞の研究をしていましたので、必要があって自家繁殖させていました。PCRでの発現確認はとても面倒なものなので、小保方さんはOct4の発現をリアルタイムで確認できるGOFマウスでやってみたかったという動機と震災の偶然が重なって、若山さんのところでこのGOFマウスを使っての酸浴実験を始めたら、たくさん光るようになったわけです。無論、若山さんも小保方さんもGFPの漏れ出しなんて、この時には知らないんです。

[連投5]
三胚様分化する細胞であるということに加えて事件のもう一つの原因になったのがこのGFPの漏れ出しというアーティファクトだったわけです。自家蛍光を識別できないなんて児戯です。博士さんたちですよ。蛍光顕微鏡の見方なんて一般教養レベルではないのですかね。この未知のアーティファクトがなかったら若山さんはこの細胞をntES化しようとは思わなかったでしょうね。博論の実験ですでに小保方さんのスフィア塊からはまともなキメラはできないと分かっていました。

[連投6]
小保方さんの三胚様分化実験でも20個に1個、50個に1個の成功率で、しかもティシュー論文では一個のスフィア塊の構成細胞が2000個以上とされている中のどの細胞が分化したのかすらわからないのですから、そのままでもう一度やろうとは思いませんね。フロリダ会議で"できてきている"のではないかと方向転換した実験の中で多数GFP蛍光が出た。この組み合わせで、若山さんはスタンダードなやり方ではキメラができないと結論された後に、ntES化を試そうという気になったのだと推測しています。このGFP確認された細胞ならクローン胚に入れられる。

[連投7]
若山さんは既に最初のGOFの実験時に同時並行でGOFのntES化を初めていると思います。最初からF1でやることはないでしょうね。ただ沢山光っているから、形態判断でF1も次にやってみて、小保方さんに最初に成功だと見せた胎児はCAG入りだということはレター論文のExtended Data Figure1-aを見ればわかる。しかもPCのプロパティに2011/11/28の4Nキメラとあって、加えて桂報告書によれば「129/Sv×B6GFP」が正しい書き方だと言ってるんですからGFPがヘテロに入っていると言ってることになる。
>>
なお、図の説明にある「B6GFP×129/Sv」 は、最初にメス、その後でオスの遺伝的背景を書く通常の表記法では「129/Sv×B6GFP」 が正しいが、不注意による間違いと思われる。(21P)

[連投8]
このCAGはAcr-CAGだというのはそのあとの12/27テラトーマからアクロシンが出ていることで分かります。これは小保方さんが渡米しているときに若山さんが上から注射したんで、小保方さんはGOFマウスのSTAP細胞を使っていますから、捏造するなら学生のGOF-ESを使うに決まっています。小保方さんは捏造なんてしませんし、無論若山さんはなおさらです。若山さんは当時内示はされていたが、まだ山梨大に行くということが人事秘で誰にも言えなかったので、小保方さんに助手の条件を提示できないままアメリカに帰られそうになるのを止めるために一時的に"できた"と言っただけなんですよ。

[連投9]
ご質問の主旨はExtended Data Figure4-dですよね。dimからはできない。FACS選別したOct4-GFP+細胞からは3/20できた。目視でよく光ってる塊のまま入れたら8/20できたというものですね。
無論、このテラトーマ作成はヴァカンティ足場を使ったものだから、ほとんど三胚様分化実験をシャーレごと皮下に埋めたようなテラトーマで、ES細胞のスタンダードなプロトコルによるテラトーマとは違います。ティシュー論文と博論でもヴァカンティ足場を使ってます。理研でも12/27テラトーマは実験ノートにもそう書かれている。問題はNOD/SCIDが理研でも使われているのかどうかですが、少なくとも12/27テラトーマはヌードマウスですね。ティシュー論文と博論では明確にNOD/SCIDです。

[連投10]
問題は12/27テラトーマ以外はどうだったのかということですが、情報がありません。ここは査読者の質問もあってなぜNOD/SCIDなのかと問われていてアーティクルのマテメソにも炎症を防ぐためと書き込んでます。12/27テラトーマは最初使っていませんから、他の実験事実がそうだったのか、今までの実験のすべてを纏めるときにNOD/SCIDで代表させたのか、小保方さんの意識の中でどういう区別になっているのかはわかりません。以上です。

>>あのねさん
「あの日」66pは博論の話です。63Pから読み直してください。後に持ち去られたとおっしゃっているのは別件との混同です。それとFLSの命名者は若山さんで、Lはリンパ球のことです。はや飲み込みしないで注意深くお願います。

1. 2019/06/01(土) 07:26:42|
2. 学さんブログ検討記録
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[連投1]
>>学さん
ティシュー論文のFig.2のコントロールのESにそのCdx2の発現があることになっていて、対する各組織細胞から採取された細胞のスフィア塊からはいずれにも見られません。
The Potential of Stem Cells in Adult Tissues Representative of the Three Germ Layers
(*ttps://www.researchgate.net/profile/Karen_Westerman/publication/47154811_The_Potential_of_Stem_Cells_in_Adult_Tissues_Representative_of_the_Three_Germ_Layers/links/556637fc08aefcb861d19869/The-Potential-of-Stem-Cells-in-Adult-Tissues-Representative-of-the-Three-Germ-Layers.pdf)

[連投2]
この論文の新規性はスフィア塊からOct4遺伝子の発現を確認し、かつその細胞が試験管内で三胚様に分化したことを確認して報告したことです。
私はこの事件に関しては若山さんはとても不運で、気の毒ですらあったと思っていますが、この三胚様組織に分化したという事実と、後に原因は分からないが丹羽さんが発見したGFPの漏れ出しという二つの現象から、この細胞はキメラはできないが、何物かではあると信じたことが、この細胞の核を使って自分のntES技術でキメラ作成し、その性質を解明してみようという心的動因を生んだのだと推測しています。

[連投3]
ティシュー論文のすごいのは発見事実です。逆にその論理の運びはど素人が読んでも変ですね。笹井さんが12/11ヴァージョン原稿を初めて見た時の感想はこのティシュー論文を読むことで推察可能ではないでしょうか。彼女はFig2でただESとスフィアは違う多能性細胞だということを言うためにこの遺伝子発現解析比較をしている。このやり方は転じてネイチャー論文ではCdx2がES細胞では見られず、TS細胞は無論、STAP細胞とFI-SCには見られるという論理になってるんです。彼女はその矛盾に気づいていません。彼女が見ているのはスフィア細胞が三胚様分化したという事実、STAP細胞からキメラができたという事実、その胎盤が光ったという事実です。彼女の論理は個別の事実に対して"分かりやすい"説明可能なデータをつけることです。

[連投4]
そしておそらく"生もの"は死に向かって"川の流れのように"経過して行くものである以上、何事も厳密には繰り返し得ないものなのだという形而上学的な裏事情(エントロピー増大則ととらえればフィジカルかもしれませんが)を反映して、どんなデータでも何回も取り直していたら論理構成に都合のいいデータは得られるのがこの細胞生物学という怪しげな科学分野の陥穽なのだということは、西川さんもどこかで書いておられたのではなかったでしょうかね。自分も学生たちにもう少し頑張ってみろと指示したと。ガンバルって、何でしょうかね。

[連投5]
論文のキメラが嘘だと言われて通らないときには、論理をいじるのではなくて、何度でもキメラを作って見せたらいいだけです。それだけの話しで、論文の書き方が悪いから通らないのだと誰がいいだしたのか。理研の罪が一番大きいんですね。だから、本当のことを報告できないで、灰色のままに多くの人々を放り出して不幸にしてしまったんではありませんかね。理研という組織の罪は理事長が引責辞任された。しかし個別の個人の誰が悪いとも言えません。

[連投6]
若山さんは苦しかったでしょうけど、小保方さんをリクルートしたくてちょっと一時的に嘘をついていたのがこんなになってしまったと8月時点で言うべきだったでしょうかね。でも、それもあの時点ではこんな論文はリジェクトされるはずだという期待がありましたね。リジェクトされていれば何もなかったことです。仏教的縁起というものなのか、運命というものなのか。以上です。


[連投1]
>>学さん
質問してくださって有難うございます。
>
卵子の細胞の核をくりぬいてから、STAP細胞の核を入れ、それをクローン胚に入れるんですか？クローン胚って？どういう状態ですか？
2019/3/26(火) 午後 10:00返信する

[連投2]
ご承知の通り、<卵子の細胞の核をくりぬいてから、>体<細胞の核を入れ>たもの、<それをクローン胚>といいます。そのまま発生させるとクローンマウスが生まれます。発生途中の胚盤胞段階でインナーセルマスを取り出してES培地で維持しているものをntESと言います。このntESを4Nキメラ胚に入れて発生させるとクローンにとても近い4Nキメラマウスが生まれます。クローン胚から作るより達成率が高く、すでに畜産では実用段階です。クローンマウスもそのntESもどちらも若山さんの発見です。若山さんの研究室はそういう研究室です。
若山さんは、GFPの蛍光からSTAP細胞は酸浴である程度リプログラムされているが、キメラまではできないので、自分の技術であるクローン胚に入れてntESを作って、キメラと幹細胞を作り、通常の体細胞ntESとの違いを研究しようとしていたと考えています。説明の場を与えて下さって感謝いたします。

[連投3]
>>あのねさん
>自分なりの一つの根拠としたのは、理研の論文で「一滴の血液からクローンマウスを誕生させることに成功」から、CD45+である白血球から取り分けリンパ球は使えないことです。

了解いたしました。ただし、使えないとは書かれていませんし、リンパ球からも作られているのではないですか。ただ再構成されているような不完全な白血球を選ぶより、非リンパ球を使った方がいいに決まっているけれども、今までは選別手段がなかったが、我々がわずかな大きさの違いを識別してFACS選別できることを示したと主張している報告なのではないですか。

[連投4]
>論文通りならFACSでリンパ球を選別すると、その余りの非リンパ球を取り出すことができます。一方で極論すれば、実験で使用のたくさんのマウスの死骸から血液をシリンジで吸って薬剤を加えて遠沈すれば、非リンパ球層は分画されます。

厳密に選別できてないと実用にならないので、かの報告の主張となるのではないですか。それと遠心分離も厳密でないのではないですか。死骸である必要はないと思いますけど後の推測ストーリーと関係してるんですね。

[連投5]
>「あの日」66pでキメリズムが少ないけど１匹のマウスに２種類の遺伝子を持つことが解析され若山氏に報告されていることです。若山氏も「このSTAP実験系は本物だ。作法は違うけど立派なキメラマウスを作ってやろう」と考えたと思います。

時系列が違っています。博論の実験では直接血液は使っていません。東京女子医大でB6のCAG-GFPマウスを購入してその骨髄からのスフィア塊を若山研に持ち込んでいます。若山さんの指示です。ティシュー論文でも骨髄を使っています。ただ、この事実はとんでもなく大きな問題をはらんでいます。

[連投6]
丹羽検証によって真正のOct4遺伝子発現している細胞は30個のスフィア塊に最大12個程度しかないと分かっています。約3万個に12個です。2500個に一個の割合です。この時若山さんはトリプシンでばらして一個ずつ挿入している。二回の実験で300個程度のキメラ胚ですが、20個づつ入れたとして6000個の細胞をインジェクトしている。そこに当たって一本の毛が黒かったので剃毛して皮膚を見たらそこも黒かったということですね。

[連投7]
骨髄には造血幹細胞があります。このころには成体幹細胞はインサイチュでその組織にしかならないとのみ考えられていて、それを外に取り出した人はいない。しかし、STAP論文が発表されて後、先に見つけられていたムーさんの筋肉細胞からインサイチュでリプログラムされていることが分かっていた幹細胞に、キンガ・ヴィニーツはiMuSCs(injury induced muscle-derived stem cell-like cells)という名前をつけ、それを外に取り出して、三胚葉に分化させ、テラトーマとキメラ形成させました。
ティシュー論文でもし小保方さんが造血幹細胞を三胚葉分化させていたのなら、世界で初めてそんな破天荒なことをした人は小保方さんであったということになるんでしょうね。ただし、小保方さんは実際には各由来組織からスフィアを作ってまたも三胚葉分化させています。確率的には成体幹細胞であったとも思えないところで、やはり刺激惹起かなとも思えますね。ただし、清成さんはできませんでした。こちらの原因も考えないといけませんね。

[連投8]
私は別にntES論にこだわってはいません。事件の解明だけが目的で考えています。
①ESコンタミだった。
②本当にできていた。
③ntES化されていた。(或いは若山さんの他の技術であっても、論文に書かれているものでない実験が行われていた。)
どれかですが①はもはや我々の間ではあり得ませんね。この①の否定はまだ0oboeさんとパートナー氏、そして楠本さんたちが追っておられますね。
②を主張する人たちはできているのになぜ若山さんが取り下げたのか、また、なぜ再現検証実験でキメラができなかったのかの理由を見つけなければなりません。③は手記にある小保方さんがリクルートされている事情との関連をよく説明できてるんです。私は今のところまだ③にいます。
連投するとリジェクトされるのでこの辺で以上とします。

1. 2019/06/01(土) 07:20:02|
2. 学さんブログ検討記録
4. | コメント:0

[連投1]
>>あのねさん

>遺伝子解析について手記「あの日」では、ChIP-seq解析を要求されたとか、リバイス後の解析に細胞の種類を集められなかったとの記述がありますがこの辺の解析とは何を指すのか把握できていません。良かったら教えてください。

手記127Pですね。どこまでご存じなのかわかりませんので、私の関心のあるところで中心になるデータをしたらば考察から再掲します。ヒートマップの問題そのものです。Ts.Marker再解析そのものです。和モガ解釈そのものです。問題はすべてこの公共データ登録されている実験そのものにあると思っています。

[連投2]
Tru-Seq
①SRR1171556　小保方　CD45 positive Cells:RNASeq.Rep1　derived from spleen C57BL/6x129/Sv　(129xB6-CAG-桂報告書)
②SRR1171557　小保方　CD45 positive Cells:RNASeq.Rep2　derived from spleen C57BL/6x129/Sv　(129xB6-CAG-桂報告書)
③SRR1171558　若山　Epi Stem Cells:RNASeq.Rep1　129/Sv　(未調査)
④SRR1171559　若山　Epi Stem Cells:RNASeq.Rep2　129/Sv　(未調査)

[連投3]
⑤SRR1171560　若山　Embryonic Stem Cells:RNASeq.Rep1　C57BL/6x129/Sv　(未調査)
⑥SRR1171561　若山　Embryonic Stem Cells:RNASeq.Rep2　C57BL/6x129/Sv　(未調査)
⑦SRR1171565　若山　FI-SC(Fgf Induced Stem Cells):RNASeq.Rep1　Oct3/4 expressing cells　C57BL/6x129/Sv　(GOF+CD1-桂報告書)
⑧SRR1171566　若山　FI-SC(Fgf Induced Stem Cells):RNASeq.Rep2　Oct3/4 expressing cells　C57BL/6x129/Sv　(GOF+CD1-桂報告書)

[連投4]
⑨SRR1171580　小保方　Low pH treated CD45 positive Cells:RNASeq.Rep1　Oct3/4 expressing cells　C57BL/6x129/Sv　(129xB6-CAG-桂報告書)
⑩SRR1171581　小保方　Low pH treated CD45 positive Cells:RNASeq.Rep2　Oct3/4 expressing cells　C57BL/6x129/Sv　(129xB6-CAG-桂報告書)
⑪SRR1171585　若山　STAP-SC(STAP derived Stem Cells):RNASeq.Rep1　Oct3/4 expressing cells　C57BL/6x129/Sv　(129xB6-Acr-CAG-桂報告書)
⑫SRR1171586　若山　STAP-SC(STAP derived Stem Cells):RNASeq.Rep2　Oct3/4 expressing cells　C57BL/6x129/Sv　(129xB6-Acr-CAG-桂報告書)

[連投5]
⑬SRR1171590　丹羽研?　Trophoblast Stem Cells:RNASeq.Rep1　CD1　(129xB6-CAG-スライド)
⑭SRR1171591　丹羽研?　Trophoblast Stem Cells:RNASeq.Rep2　CD1　(129xB6-CAG-スライド)

[連投6]
ChIP-Seq
①SRR1171553　小保方　CD45 positive Cells:ChIPSeq.H3K27me3　derived from spleen　Oct3/4::gfp C57BL/6　(GOF-桂報告書)
②SRR1171554　小保方　CD45 positive Cells:ChIPSeq.H3K4me3　derived from spleen　Oct3/4::gfp C57BL/6　(GOF-桂報告書)
③SRR1171555　小保方　CD45 positive Cells:ChIPSeq.input　derived from spleen　Oct3/4::gfp C57BL/6　(GOF-桂報告書)

[連投7]
④SRR1171562　若山　Embryonic Stem Cells:ChIPSeq.H3K27me3　C57BL/6x129/Sv　(未調査)
⑤SRR1171563　若山　Embryonic Stem Cells:ChIPSeq.H3K4me3　C57BL/6x129/Sv　(未調査)
⑥SRR1171564　若山　Embryonic Stem Cells:ChIPSeq.input　C57BL/6x129/Sv　(未調査)

[連投8]
⑦SRR1171567　若山　FI-SC(Fgf Induced Stem Cells):ChIPSeq.H3K27me3　Oct3/4 expressing cells　C57BL/6x129/Sv　(129xB6-Acr-CAG-桂報告書)
⑧SRR1171568　若山　FI-SC(Fgf Induced Stem Cells):ChIPSeq.H3K4me3　Oct3/4 expressing cells　C57BL/6x129/Sv 　(129xB6-Acr-CAG-桂報告書)
⑨SRR1171569　若山　FI-SC(Fgf Induced Stem Cells):ChIPSeq.input　Oct3/4 expressing cells　C57BL/6x129/Sv　(129xB6-Acr-CAG-桂報告書)

[連投9]
⑩SRR1171582　小保方　Low pH treated CD45 positive Cells:ChIPSeq.H3K27me3　Oct3/4 expressing cells　C57BL/6x129/Sv 　(129xB6-CAG-桂報告書)
⑪SRR1171583　小保方　Low pH treated CD45 positive Cells:ChIPSeq.H3K4me3　Oct3/4 expressing cells　C57BL/6x129/Sv　(129xB6-CAG-桂報告書)
⑫SRR1171584　小保方　Low pH treated CD45 positive Cells:ChIPSeq.input　Oct3/4 expressing cells　C57BL/6x129/Sv　(129xB6-CAG-桂報告書)

[連投10]
⑬SRR1171587　若山　STAP-SC(STAP derived Stem Cells):ChIPSeq.H3K27me3　Oct3/4 expressing cells　C57BL/6x129/Sv　(129xB6-CAG-桂報告書)
⑭SRR1171588　若山　STAP-SC(STAP derived Stem Cells):ChIPSeq.H3K4me3　Oct3/4 expressing cells　C57BL/6x129/Sv　(129xB6-CAG-桂報告書)
⑮SRR1171589　若山　STAP-SC(STAP derived Stem Cells):ChIPSeq.input　Oct3/4 expressing cells　C57BL/6x129/Sv　(129xB6-CAG-桂報告書)

[連投11]
⑯SRR1171592　丹羽研　Trophoblast Stem Cells:ChIPSeq.H3K27me3　CD1　(CD1系統-スライド)
⑰SRR1171593　丹羽研　Trophoblast Stem Cells:ChIPSeq.H3K4me3　CD1　(CD1系統-スライド)
⑱SRR1171594　丹羽研　Trophoblast Stem Cells:ChIPSeq.input 　CD1　(CD1系統-スライド)

[連投12]
SMARTer-Seq
①SRR1171570　若山　Blastocyst stage embryos:RNASeq.SMARTer.Rep1　C57BL/6x129/Sv　(未調査)
②SRR1171571　若山 　Blastocyst stage embryos:RNASeq.SMARTer.Rep2　C57BL/6x129/Sv　(未調査)
③SRR1171572　小保方　CD45 positive Cells:RNASeq.SMARTer.Rep1　C57BL/6x129/Sv　(未調査)
④SRR1171573　小保方　CD45 positive Cells:RNASeq.SMARTer.Rep2　C57BL/6x129/Sv　(未調査)

[連投13]
⑤SRR1171574　若山　Embryonic Stem Cells:RNASeq.SMARTer.Rep1　C57BL/6x129/Sv　(未調査)
⑥SRR1171575　若山　Embryonic Stem Cells:RNASeq.SMARTer.Rep2　C57BL/6x129/Sv　(未調査)
⑦SRR1171576　若山　Morula stage embryos:RNASeq.SMARTer.Rep1　C57BL/6x129/Sv　(未調査)
⑧SRR1171577　若山　Morula stage embryos:RNASeq.SMARTer.Rep2　C57BL/6x129/Sv　(未調査)

[連投14]
⑨SRR1171578　小保方　Low pH treated CD45 positive Cells:RNASeq.SMARTer.Rep1　Oct3/4 expressing cells　C57BL/6x129/Sv　(未調査)
⑩SRR1171579　小保方　Low pH treated CD45 positive Cells:RNASeq.SMARTer.Rep2　Oct3/4 expressing cells　C57BL/6x129/Sv　(未調査)

[連投15]
あのねさん、とりあえず、このデータを確認なさってください。次にTs.Marker再解析と照合されてください。Sox21の問題以上に<やっぱりね>のFI-SC細胞のTS特異的マーカー発現に注意なさってください。そしてレター論文のデータとの矛盾、そして本文そのものの非論理に注目なさってください。皆、この錯綜した結果を解きほぐそうと努力しているんです。以上です。私はジムさんの*ttp://blog.livedoor.jp/obokata2657/archives/28578813.htmlに居ます。

1. 2019/06/01(土) 07:14:10|
2. 学さんブログ検討記録
4. | コメント:0

[連投1]
>>学さん
>この時期の小保方氏は、STAP細胞は用意できただけかな？と思います。幹細胞実験には小保方氏は参加しておらず、若山氏から譲られた細胞しか持ち合わせていないのではないか？と想像します。

大まかにそういうことだと思います。

[連投2]
ただし、STAP細胞を作らされているということはその都度どんなマウスを渡されているかはわかっています。GRASへの解析依頼に関しては基本、長である若山さんの依頼認可が必要ですから若山さんの指示で行っていて、この手伝いを詳しい先輩(共著者の野老博士さんだと思います)が手伝ってくれたと手記では説明されています。従って小保方さんが全く関与していないということはないですね。ただ、笹井研に移ってからの分析は小保方さんが行っていて、このヒートマップは同じく共著者の門田さんの仕事ですね。笹井さんがかわいがっていた人のようです。

[連投3]
GRASからの再度サンプル提出要請はないです。彼らは提出されたものを分析するだけです。再提出しているのは笹井さんや小保方さんです。樹上図がうまく理屈どうりにならなかったからですね。丹羽さんのCD1のTSは若山さんの作ったTSが分化していたらしいという理由で提供されたものです。これは報告書に書かれています。ところが遠藤さんが分析した二つのTSラインはB6と129のF1だという結果になっている。でも登録はTSは全部CD1になっています。Ts.Markerさんの分析の記事のところにも書きましたが、この登録事務時にも何か混乱があるようだと推測しています。というのもあまりに矛盾が多いんです。

[連投4]
で、肝心のヒートマップですが、まず最初のaはSTAP細胞の全RNA発現遺伝子ですね。それに対してESとSTAP-SCとTSとFI-SCの同じ遺伝子発現がどうであるかと比較されている。STAP細胞が基準ですからこのときのSTAP細胞に例えばSox21が発現していなければ、他の細胞には発現していても項目には上がりません。そういう比較ですね。bは同様にES細胞基準です。
二つの問題があると思いますね。
①酸浴されているのはSTAP細胞だけで、GRAPDH値が他と違う。
②時々の細胞の状態によって発現RNAが変わる可能性。特にSTAP細胞はまだ確かな幹細胞であると確定していない。

[連投5]
①は相沢論文に論じられていることです。ハウスキーピング遺伝子が動いたら比較はできません。
②はキメラができたとされているから笹井さんたちが油断したんで、これがまだ博論段階の研究だったら、こんな分析は何も言えてることになりません。でも、キメラはできていて、STAP細胞は幹細胞だと、小保方さんは言うに及ばず、笹井さん、丹羽さんも含めて若山さん以外の関係者全員が信じているんです。事件は単相ではありません。以上です。
(追伸)丹羽論文記事のところにもコメントしています。こちらは受け付けられていますが、まだアップされていません。お気づきでないのかとも推測しています。





[連投1]
>>学さん
自家蛍光はいろんなスペクトルを出すので、緑色フィルターだけで見るのではなくて、赤色フィルターでも見ますね。因みにライブセルイメージングでは同時に多画面を見れるので、緑も赤も同時に確認されたら自家蛍光が混じってることだけはわかりますが、手記にある通り、小保方さんはキメラ成功前から若山研でライブセルイメージング実験をラボメンバーに手伝ってもらって自家蛍光確認も行っています。(86P)

[連投2]
実験の都合次第で自家蛍光の無いものだけを取り出すこともできるでしょうし、自家蛍光の混じっている細胞しか観察されず、加えて必要があるなら、緑色蛍光が本当に挿入マーカー遺伝子の蛍光であるかどうかは別の手段で確認できますね。
①挿入人工遺伝子の存在をPCRで確認する方法
②マーカー標的している目的のmRNA自体の存在をPCRで確認する方法
③目的のmRNAの発現結果であるタンパク質の存在を免染確認する方法
丹羽さんは取り混ぜてすべて行っていますね。

[連投3]
自家蛍光の存在は蛍光顕微鏡を見るときの初歩知識で、関連の専門家ならだれでも知っています。STAP細胞の緑色蛍光を自家蛍光だと最初にいいだしたのがノフラーさん、日本では関さんですが、若山さんの人脈ですね。ノフラーさんのブログで、誰かさんがハアイ、ポールと呼び掛けて問答があるのですが、対してTs.Markerさんの<やっぱりね>質問はガン無視されていることはご承知のとおりです。

[連投4]
>>ＧＯＦマウスでないマウス由来肝細胞を酸浴して得た細胞凝集塊では自家発光はせず、ＯｃｔｍＲＮＡと、蛋白産生が見れています。

ここは自家蛍光もあったかどうかは確認写真がありませんが、ただ、自家蛍光の無いものを使っているということでしょうね。アルブクレマウスですね。僕の勘違いは後で述べます。

[連投5]
>>ただし、Oct陽性細胞の割合は、HCl酸浴肝細胞と酸浴させていない肝細胞と同程度であり、肝細胞にはそうした細胞が含まれるか、あるいは非特異的な検査結果か？とのことのようです。

これはFigure3-aのことをおっしゃってるのだと思われますが、コントロールのES細胞ではCAG-GFP遺伝子と内在性Oct4遺伝子の発現量がそれぞれ1に設定してあり、赤と緑の棒グラフで示されていて、それに対して、GOFマウスの肝細胞を乖離した時点で既にOct4-GFPが対数スケールで7%程度発現している。ATP処理しても8%程度、HCL処理すると10%に近いという結果ですが、それに対する内在性Oct4遺伝子の発現は検出限界のゼロです。つまりGFPは光ってるが肝心の内在性Oct4遺伝子の発現はほとんど無いと言ってるわけですね。

[連投6]
これはqPCRの検証でmRNAそのものを検出しているのでもちろん自家蛍光の問題なんかとは無関係です。Oct4-GFP人工遺伝子は発現しているが、内在性のOct4蛋白質を作る遺伝子そのものは発現してないという結果ですね。丹羽さんはそのGFPの異常発現をleaky expressionと言ってますが、原因には触れていませんね。
Oct4-GFPの設計は内在性のOct4遺伝子を動かすためのプロモーターと同じものをGFP製造プログラムにつなげていますから、一方が動き出したら他方も動く仕込みです。でも生体の中でのことですから、酸浴亜致死下では双方の発現がどうなるかまでは考えられていませんよね。

[連投7](ヤフーの書込不可表示で中断してました。)
またコントロールのESのGFPはCAG-GFPです。なぜOct4-GFPマウスのESを使わなかったのか、そして、ES細胞を酸浴させるとそのOct4-GFPの発現がどうなるかをどうして確認しなかったのかという問題もありますが、理研の予算を使って特許申請維持できるのかということを確認するための実験をしているわけですから、Oct4-GFP人工遺遺伝子の設計が酸浴などという非常識な条件下に対してどうであるかということを研究するのが目的ではないわけですよね。そんなこと始めてたら検証は延々終わらないことになります。

[連投8]
では、理研に来る前に小保方さんが追及していた細胞は何であったのかというと、無論、ハーバードと東京女子医大時代に小保方さんはGFPなんて使っていません。qPCR検証です。丹羽さんはFigure3-aの実験で、酸浴スフィア塊から内在性Oct4遺伝子が発現しているとしたらとても微量だと気付いたので、今度はFigure3-bでコントロールをES10個分にしました。その結果が小保方さんが理研に来る前から追いかけていた細胞のようですよね。

[連投9]
丹羽さんの検証では一回の実験で50万個の肝細胞を使って最大ES細胞換算で12個分の発現量しかなかった。その12個分の発現量は12個に集まっているかどうかすら分からない。たくさんの数の細胞に微量に分散しているものの総体であるかもしれない。しかし、その一個にES細胞1個分の発現量のある酸浴細胞が1個でも存在していると大量に実験すると三胚葉に分化誘導できるシャーレが出現するかもしれない。50万個の細胞から丹羽さんはスフィア塊を20から30個作れている。小保方さんはその一回30万個の実験を何十回も行って何百個のスフィア塊を使って、ついに三胚葉分化を確認してるんでしょ。(手記53P)それが今あるティシュー論文でヴァカンティが今もなお特許申請継続している実験結果です。

[連投10]
物理刺激と酸浴刺激の違いはあるが、小保方細胞の出現経過は共通しているのではないでしょうかね。無論、こんな微量な細胞でキメラがネイチャー論文のようなあんなに高い確率でできてくるわけがありません。キメラは若山さんの曰くつきの"いたずら"です。ただ、その曰くはともかくとして、そんないたずらが可能であったのは丹羽さんが見つけたGFPの漏れ出し現象があったからです。原因は分からないが、これを何物かだと若山さんも思い込んだ。小保方さんも今までの細胞とは違って大量にできてきていると思いこんでいるんです。だから騙され続けた。二人とも共通にGFP蛍光のアーティファクトに騙されていたんです。

[連投11]
若山さんはよく光ってはいるけどこの細胞からキメラはできないと知っている。自分がキメラ実験してますからね。ただ、GFPの光っていることが内在性Oct4発現と対応していると信じ込んでいる。丹羽さんの検証実験はまだ行われていません。若山さんはこの細胞の核をクローン胚に入れてみたかったんですよ。それはいたずらなんかじゃない。正真正銘の科学者の好奇心ではないですか。そして実際にそれを行ってキメラと幹細胞を作ったが、その時に小保方さんを山梨大にリクルートしたいという別の事情と重なって、一時的な嘘をついたんです。その因果がここまで事件を引っ張ってきたのだとみています。

[連投12]
>>つまり、ＡＴＰ酸浴後肝細胞において、細胞は初期化遺伝子を働かせたということです。
>>ＴＳさんの解析でも明らかなように、ＳＴＡＰ細胞は、従来の遺伝子制御とは異なる細胞です。

その通りだと思います。いや、ハーヴァード時代からその意味では彼女の細胞は本物です。

①ハーヴァード以来の小保方細胞
②理研での酸浴細胞
③若山さんの曰くつき"いたずら"キメラと幹細胞

三つを分けて考えるべきだと思っているんです。

[連投13]
>>ExtFig4aの蛍光図は、肝細胞であることをしめす緑色蛍光です。・・・the cell aggregates were derived from 8-days old of Alb-cre/Rosa-GFP Tg mice.

ご指摘有難うございます。僕は以前からOct4-GFPだと勘違いしてました。3個目のスフィア塊にOct4蛋白染色がないのにGFPが光っているのを漏れ出し原因だと思ってました。ただExtFig4aはFig4aですね。

[連投14]
>>凝集塊は1０個位の細胞数にみえますけど、この位の数以下でないと胚には入らないような気がします。スフィア塊は、写真からみると大きいものから小さいものまで、かなり幅があります。

ティシュー論文に「Individual spheres possessed >2000 cells.(The Potential of Stem Cells in Adult Tissues Representative of the Three Germ Layers:Sept.2010)」とあります。STAP論文にもどこかにあったと思いますけど今見つけられません。いずれにせよ、勘違いなさっておられるので、図のブライトフィールドの三番目のスフィア塊の直径上に並んでいる細胞数を数えてみてください。12個程度でしょ。半径が6個のスフィアの体積は4πr^3/3で904個程度と逆残できます。写真はパラフィン固定して薄くスライスした中央付近の断面です。上は桑実胚なので16細胞期ですが、下は胚じゃなくてスフィア塊です。若山さんがナイフで切り分けてインジェクトするあれです。以上です。

連絡
>>学さん
場違いなところに前回の残りを投稿してすみませんが、ヤフーがおかしいようです。途中で投稿できなくなりました。以下のような表示です。(一部です。)
>
ご覧になろうとしているページは現在表示できません。
ご不便をおかけして申し訳ございませんが、お客様がご覧になろうとしているページは現在表示できません。 一時的なエラーですので、しばらく時間をおいてから再度お試しください。
もし、何度もこのページが表示される場合は、以下をご確認ください。・・・

1. 2019/06/01(土) 07:09:01|
2. 学さんブログ検討記録
4. | コメント:0

[連投1]
>>Ts.Markerさん
私はIGVの見方がわかりません。濃く出ていれば発現が多い、薄いのは少ないという素人感覚で〇X△と認識して分類しています。要望です。まず、今回のHH,H,X,N/A,L,LLの意味を解説してください。次に、Tru-seq, SMARTer, ChIP-seqの区別を教えてください。特に前者二つはどちらもRNASeqと書かれていて、どう違うのかがわかりません。たぶん、どちらかが2012年8月の分析で、他方が2013年1月以降の分析でくわえられたのかとも推測しますが分かりません。それから細胞種はES,STAP,STAP-SC,FI-SC,TSと分類されていますが、あなたの分析したライン別に記載されてください。

[連投2]
このデータはあなたしかお持ちでない(アルイミオウジ氏のところにもありますが)。我々はあなたのブログに出ているものだけしか把握していません。現在どれだけ分析が進んでいるのかは存じませんが、新しく加えられているデータがあったらそれも更新していただければ有難いです。我々が今持っているデータは、
Tru-seq=ES560,STAP580,STAP-SC585,FI-SC565,TS590,EpiSC568,CD45+556
SMARTer=ES574,STAP578(Bowtie2,TopHat2)
SMARTer=STAP581(Sox21のみ)
ChIP-seq=ES563,STAP583,STAP-SC588,FI-SC568,TS593
ChIP-seq<やっぱりね>=FI-SC567,FI-SC568,FI-SC569
です。番号は560→SRR1171560の意味です。

[連投3]
ご承知の通り、このデータの整理は相当の混乱があって、2年間のデータを合わせて整理されていて、かつ、いつ誰がどういう経緯で登録したのかもわかっていません。例えばF1の細胞はすべてがC57BL/6x129/Svと記載されているんですが中身がそれぞれ全く違っている。TSもすべてCD1と書かれていて丹羽研提供は桂報告書で分かっていますが、遠藤さんが分析した590,591はB6と129が出ていて若山さんの作ったF1のTSのようです。この公共データ登録は小保方さんが一旦理研を経由して登録していて人の手が介入しているようでもあります。ライン別にちゃんと識別されていなければ後の検討に差し障る理由です。以上要望でした。



[連投1]
>>学さん
アルイミオウジ氏も気づかれていなかったですが、～10は肩の小さい3が脱落しているんです。10の三乗です。つまり～1000で、スフィア塊は最大1000個程度の細胞で構成されているという意味です。このことはスフィア塊の写真を見ればわかる通りで10個以下なんてことはあり得ませんし、球を想定して計算しても1000個程度とわかりますし、ティシュー論文以来細胞塊は約1000個の細胞でできていると書き継がれていることでもあります。誤植の類なんですけど、あの分析に丹羽さんが10個のESを基準にしていることでなんとなく曖昧に気づかずに読み過ごされていることが多いようです。

[連投2]
（図3b）は約1000個の細胞で構成されているスフィア塊を10個のES細胞のマーカー遺伝子発現量と比較したものが19例並べてあるグラフです。メモリは対数表示で、Oct4に関して言えば0.1のライン以上が4例あるということです。10個のESの発現量との比較ですから、0.1の近辺では1個分が発現しているということです。1000個の中の1個です。しかも比較的発現のある19例を並べてあるんですから、何もない事例もあるということです。1000個の19例だと19000ですが、スフィア塊は20から30個程度形成されたと書かれています。で、結果的に最大30スフィアの20%つまり最大6個のスフィアのそれぞれに1個か2個の内在性Oct4遺伝子発現があった。つまり最大12個あったという結論なんです。それは最初の50万個の細胞に対しては0.0012–0.0024%であるということですね。

[連投3]
これでもティシュー論文では試験管内三胚葉分化も足場付きテラトーマならできているわけです。それは大量に入れた細胞の中の一個でも多能性細胞であれば分化するからですね。これが今でもヴァカンティが特許申請継続している理由です。でも、相沢さんと丹羽さんの検証目的は理研の名前で出しているネイチャー論文の骨子通りに特許も申請していますから、キメラが再現できるか否かだけが検証の目的で、理研の予算を使って行っているのですから、ティシュー時の細胞が何であったかなどという検証はやれません。目的が違うということです。結果は、再現できないから特許申請は取り下げるというものです。

[連投4]
そこの理解に関して一致できれば、今度は丹羽論文の曖昧さに関しても指摘できることになると思います。ES10個分の発現量と比較して0.1は確かに1個分ですけど、これは必ずしも一個だとは言えませんよね。1/100が10個集まったら1/10です。1/1000が100個集まっても1/10です。とても微量な発現がたくさんあるという可能性を否定できていませんね。

[連投5]
（図4a）に2個のスフィア塊の中で11個のOct4発現個別細胞が免染で黄色く着色されているのが見えます。結論には6個のスフィア塊の中に1から2個だったはずですね。これは1から2個分の発現量と読み替えないといけないんでしょうね。
>>However, the frequency was very low; 5 × 10^5 liver cells yielded only ~30 cell aggregates, in which about 20% of the cell aggregates contained 1–2 Oct3/4 positive cells, indicating a frequency per seeded liver cell of 0.0012–0.0024%.

[連投6]
このことはGFPの蛍光に関しても言えるかもしれません。Ooboeさんのパートナー氏は予備的再現実験時の小保方さんの作った自家蛍光ではない沢山の蛍光細胞の出現写真をガンバレブログにアップされています。亜致死酸浴下条件でOct4-GFPが内在性Oct4遺伝子発現に正確に比例して発現するのか否かはわかっていません。こんな実験をしたのは小保方さんが初めてだからです。丹羽さんも1割程度の漏れ出しという現象を発見しています。分かってないことが多いですけど、前述した通り理研の検証実験は特許申請維持の可否検証が目的ですので多くを要求することはできませんね。事件は複雑なので、多面的に検討していくしかないと思っています。以上です。

1. 2019/06/01(土) 07:06:03|
2. 学さんブログ検討記録
4. | コメント:0

[連投1]
>>Lさん
あなたのコメント引用に関して私の誤解があったようでお詫びします。Sox21に関してあなたはTS特異的マーカーであるとは思われていないという点了解しました。私が問題にしているのは遠藤論文でSox21をTS特異的マーカーとして分析の論拠にしている点です。

[連投2]
>>学さん
遠藤論文は、彼の調べたFI-SCが登録上B6/129とされているのに、ES特異的マーカーに関してはB6のSNPsしかなく、TS特異的マーカーに関してはB6が多いが違うものが少し入っていると主張しています。そのTS特異的マーカーとしてElf5とともにSox21が選ばれているんです。そしてTSが混じっていると結論し、かつ、そのTSは丹羽さんが提供したCD1マウス系統のTSだと主張しているんです。根拠は周知のものでなければならない。一部の人間だけしか正しいと思っていないことを根拠にするなんてことはあってはなりませんよね。

[連投3]
アクロシンの件は、2014年になった事件後、第三者機関の分析結果を、遠藤さんが、若山さんを経由して、入手し、アクロシンだと言い出したものです。2012年時の研究中のGRASへの試料持ち込み経緯とはまた別件です。これから検討することになります。

[連投4]
>>Ts.Markerさん
あなたの固定トゥイートは以下です。
>>
Coexpression of ES and TS markers can be seen in registered data of FI-SC Chip-seq which was regarded as ES.
How can we explain this fact?

そして<やっぱりね>のTS特異的マーカーはCdx2,Eomes,Itgα7でSox21はありませんね。加えて解析されているFI-SCは567,568,569で、桂調査でアクロシン入りと分かっています。対して、遠藤さんが分析したFI-SCは565,566です。無論あなたも解析されている。これらは桂報告がB6+1割のCD1と結論しています。

[連投5]
そして、私の質問は以下でした。
①遠藤論文が出る以前にSox21がTS特異的マーカーであるとする論文があるか。
②遠藤氏は分析時にどうしてTS特異的マーカーとして常識的な小保方論文にあるようなCdx2,Eomes,Itgα7,Elf5という中から二つを選ばなかったか。どうしてそこに一般的でないSox21を入れたのか

[連投6]
現在の知見でSox21がどういう働きをしているのかという科学的興味には今は入らないようにしましょう。桂報告書がGOF-ESと呼んでいるのは学生である糸井さんか、京極さんが作ったとされているntESのことです。無論李さんは当時博士研究員で彼の細胞ではありませんね。小保方さんはコントロールとして研究用に一皿もらっていて、これは中身はともかくとして木星リストの中にラベル書きされたチューブがあります。この核移植ESの話と、最近のSox21の研究と、若山研での8細胞期以前の受精卵ES細胞研究の話を時系列無視でつなぎ合わせて何か考えても事件解明目的としては意味がありませんから、この話も今はやらないようにしましょう。

[連投7]
学さんが学さんらしく直感で先走られているように、アクロシンが入っていると言い出したのは若山さん言い出しっぺの第三者機関解析データ経由の遠藤さんです。そして遠藤さんが565,566にコンタミがあると言ったんです。そしてTS特異的マーカーがあるから、TSのコンタミだと言ったんです。桂チームはTSのコンタミだとは言ってなくて、別の細胞でCD1である可能性が高いものが1割程度と言ってる。

[連投8]
ここはExtended Data Figure 5-eにあるBFPとGFP共挿入ESの提供元が丹羽研であるとマウス背景がCD1である可能性が出て来るところです。この実験はGOF由来FI-SCに10%の共挿入ESを混ぜている。
TSの混入を言い出したのは遠藤さんです。その根拠にSox21が使われている。ESであった可能性を先回りしてつぶしていることになりますね。以上です。ここまでのところの御批判をいただきたい。

1. 2019/06/01(土) 07:03:14|
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